ROS总是检测不好，这几点技巧是否对你有用？

niwanmao

论坛内经常会有站友提到ROS测不好，ROS测不好的原因有多方面的，在此，从Methods in Molecular Biology一书中摘录并翻译部分关键性技巧，与正在做ROS的你分享：

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hwthwt

倪老师，我用DCF检测ROS，做出来的结果如图。
Negative Control是未经处理的细胞+DCF探针
1和5分别为不同浓度的给药组。
我根据Negative Control组设了门，请问我这样设门对么？

niwanmao

闷油瓶 发表于 2021-9-9 09:11
请问读取阳性区域MFI的变化是什么意思？怎么操作的？

意思是根据阴性对照，设置一个阳性门，软件分析门内的MFI数值

云木香

niwanmao 发表于 2021-11-21 08:53
可以的，是有文献这么做的。

谢谢倪老师解惑

niwanmao

云木香 发表于 2021-11-20 19:56
倪老师您好，请问 能不能仅用空白细胞调试电压，而不划分ROS 阳性和阴性区域，在最后的样品处理探针孵育后 ...

可以的，是有文献这么做的。

云木香

倪老师您好，请问 能不能仅用空白细胞调试电压，而不划分ROS 阳性和阴性区域，在最后的样品处理探针孵育后计算一整个的平均荧光强度。

我的考虑点是，ROS探针在检测细胞ROS时，是根据细胞中ROS含量来反映的，ROS含量越多，图形越往右移，在直方图中是一个连续的表现形式，而不是像其他探针一样明显的把细胞分为阳性和阴性两群（泾渭分明）。

云木香

cynthia 发表于 2021-11-10 22:17
谢谢倪老师的回复，我已经跟他们那边交流很多次了，除了让我增加阳性对照的浓度，也没有其他方案提供给我 ...

这个我问过碧云天的技术了，给的回复说，他们的阳性对照确实是有问题的，不能保证所有细胞都能使用，我也买他们的，确实是不行。

caodinglingge

倪老师，想请教一下，您之前说过“胰酶消化收集细胞并用PBS洗2次后上机”，那么这个不需要用血清中和胰酶吗？如果这时候用血清的话肯定会影响探针的，请问这个是怎么解决的？谢谢！

cynthia

niwanmao 发表于 2021-11-12 09:59
如果确认操作没问题，我建议换成Thermo的ROS试剂再做做看。

谢谢您的回复，我再自己试试看！

niwanmao

cynthia 发表于 2021-11-11 10:45
谢谢您的回复，阳性组1其实比阴性还低，阳性组2反而还稍高一点点点。加药组2是高的最多的，虽然也只是高 ...

如果确认操作没问题，我建议换成Thermo的ROS试剂再做做看。

cynthia

niwanmao 发表于 2021-11-11 10:39
你将这些样本按阴性、加药组1、阳性组1，三个叠加在一起，可看出区分度。从数字看，应该有趋势，但不明显 ...

谢谢您的回复，阳性组1其实比阴性还低，阳性组2反而还稍高一点点点。加药组2是高的最多的，虽然也只是高一点点。直方图把三个叠加在一起，实在是不能看，几乎是重叠的。老师，现在我的问题就是不知道应该如何改进实验方案和条件，我已经不知道哪里可能会出问题了，这是我做的第四遍，也改了四遍条件，所以实在是想不到突破口，才来这里请您赐教！