1476 zengyikaren LV2
2019-12-9 00:39:58 1.同型对照的背景强于特异性抗体的现象
同型对照被广泛用于非特异性结合的背景对照，因为我们假定同型对照可以和对应的特异性抗体有相同的背景结合（需注意不同厂家的抗体，即便是同样的抗体类型，会表现出不同非特异性结合背景）。然而Morten N. Andersen 等[1]发现，使用anti-Tie2（一种低水平表达于正常人单核细胞的血管生成素受体蛋白）AF647和其同型对照IgG1 AF647（两种抗体来源同样厂家，抗体浓度）对CD14+ 单核细胞的染色，却发现了IgG1 AF647对CD14+单核细胞的结合能力甚至超过了anti-Tie2 AF647，说明了IgG1 AF647同型对照的背景结合能力强于anti-Tie2 AF647。因此这样的流式图结果就会让我们误以为这群CD14+单核细胞上没有Tie2（见图1）
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图1. Isolated CD14+ cell 对同型对照IgG1 AF647比特异性抗体anti-Tie2 AF647的非特异性结合还要强的结果。
2.通过Fc block 纠正同型对照的非特异性结合
研究者通过Fc block，可以将IgG1 AF647 的非特异性结合降低至unstained tube的水平（见图2 3rd row vs 1st row 第一列）。
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图2. 通过Fc block可以将CD45+/live/single cell对IgG1, IgG2a的非特异性结合调整至unstained tube水平（注意此处unstain和stain指的是isotype）。
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图3. Fc block原理示意图[2]3.汇总对比CD3+ T cell, CD14+Monocytes, CD19+Bcell, CD56+NK cell, CD11b+/monocyte-derived macrophages群体对IgG1, IgG2a, IgG2b非特异性结合
最后作者汇总比较了Fc block 对CD3+ T cell, CD14+Monocytes, CD19+B cell, CD56+NK cell,CD11b+/monocyte-derived macrophages群体对IgG1, IgG2a, IgG2b非特异性结合的影响，得出结论：人单核细胞和monocyte-derivedmacrophages对mouse IgG1, IgG2a型蛋白显示出强烈的非特异性结合，但对IgG2b型蛋白结合不明显。然而，人B细胞，T细胞和NK细胞对这三种小鼠源同型蛋白未显示出明显的结合。因此，如果我们实验的分析的细胞属于人Monocytes或者monocyte-derived macrophages，需特别注意Fc block的重要性，警惕仅仅靠同型对照确定圈门可能的错误。
Reference:
[1]Elimination of erroneous results in flowcytometry caused by antibody binding to Fc receptors on human monocytes andmacrophages, Cytometry A. 2016 Nov;89(11):1001-1009. doi: 10.1002/cyto.a.22995.Epub 2016 Oct 12