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[结构和原理] 调节补偿时单染管的阳性率在95%以上,阴性细胞群没有

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发表于 2020-2-13 17:00:36 | 显示全部楼层 |阅读模式
5流星
本帖最后由 chaoslure 于 2020-2-14 08:29 编辑

在做干细胞的流式补偿时遇到这样一个问题,由于干细胞经分离培养细胞的纯度很高,在进行流式分析时,我们按照常规流式操作,第一管阴性对照,第二管FITC单标+PE-IG,第三管PE单标+FITC+IG,第四管PE+FITC双标。在第二管和第三管可以看到阳性率很高几乎看不到阴性细胞群。通常在调节补偿时需要一次上样既有阴性细胞群又有阳性细胞群,出现这种情况我们应该如何调节补偿?
图片5.jpg
我想到两个思路希望各位老师指点一下:
方法一:
在实验过程中,既然第二管和第三管没有阴性细胞群,那么我们可以制造阴性细胞群,比如在上样前将第一管的细胞取部分加入到第二管和第三管中。
方法二:
在分析过程中,在分析时第二管和第三管没有阴性细胞群,我们可以将第一管的图做为阴性对照,分别计算三管细胞的EP和FITC的MFI值,手动调整补偿矩阵让第一管的MFI-PE≈第二管的MFI-PE,第一管的MFI-FITC≈第三管的MFI-FITC。
不知哪种方法更好,或者有更好的调节补偿方法?请各位老师指点一下。

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不混在一起,处理过程中的差异、上机时的差异,都会影响两者的相对位置,造成补偿不准。
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发表于 2020-2-13 17:00:37 | 显示全部楼层
chaoslure 发表于 2020-2-16 10:00
倪老师,因为有些实验按照之前的方法已经做完了,无奈之下只能按照方法二分析数据,所以想跟您请教一下, ...

不混在一起,处理过程中的差异、上机时的差异,都会影响两者的相对位置,造成补偿不准。
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发表于 2020-2-14 11:00:29 | 显示全部楼层
用方法一
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 楼主| 发表于 2020-2-16 10:00:25 | 显示全部楼层

倪老师,因为有些实验按照之前的方法已经做完了,无奈之下只能按照方法二分析数据,所以想跟您请教一下,用方法二分析数据会出现那些不足的地方,分析得到的结果是否可信?
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发表于 2021-4-14 13:14:17 | 显示全部楼层

用方法一的话,第一管的意义是啥?
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发表于 2021-4-14 13:42:28 | 显示全部楼层
闷油瓶 发表于 2021-4-14 13:14
用方法一的话,第一管的意义是啥?

第一管如果同型对照没有加,那么严格的叫法叫「空白对照」,仅用于调节电压;

如果加了同型对照,就叫「同型对照」,在isotype选择正确的情况下,可用于反映背景荧光和非特异性结合水平。
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发表于 2021-4-14 16:59:34 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-4-14 13:42
第一管如果同型对照没有加,那么严格的叫法叫「空白对照」,仅用于调节电压;

如果加了同型对照,就叫「 ...

是不是在方法一的情况下,第一管如果是同型对照管,就可以用来调节电压和补偿,把那群细胞非特异性荧光完全调到阴性位置,然后用第一管设置好的电压和补偿来跑第二管和第三管,分别调节第二管和第三管的补偿就可以了?我也是新手,希望老师不要嫌弃
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发表于 2021-4-14 19:44:54 | 显示全部楼层
闷油瓶 发表于 2021-4-14 16:59
是不是在方法一的情况下,第一管如果是同型对照管,就可以用来调节电压和补偿,把那群细胞非特异性荧光完 ...

第2、3管如果同时有阳性和阴性群,是可以。
但楼主说的是,2、3管没有阴性群,所以就不行。
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发表于 2021-4-16 16:06:42 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-4-14 19:44
第2、3管如果同时有阳性和阴性群,是可以。
但楼主说的是,2、3管没有阴性群,所以就不行。 ...

那我学习的时候可能理解错了,我理解的是用阴性细胞(第一管)确定阴性边界,然后用单染管确定每种荧光在其他通道的溢漏来调好补偿(不用阴性细胞,只要有阳性信号即可),然后用阳性管来正式测量
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发表于 2021-4-17 09:14:55 | 显示全部楼层
闷油瓶 发表于 2021-4-16 16:06
那我学习的时候可能理解错了,我理解的是用阴性细胞(第一管)确定阴性边界,然后用单染管确定每种荧光在 ...

阴性细胞确定界限没错,但此阴性非彼阴性。这里的所谓“阴性”是空白对照,真正的阴性应该是:
1、生物学阴性对照(即同一个样本或同一类样本,不表达该标记)。
2、FMO对照。
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