一、准备
物品准备：灭菌手术器械、灭菌 5ml EP 管、灭菌 2ml EP 管、平皿、50ml EP管、15ml EP 管、70u 细胞筛网、流式管（提前标好）、巴氏管、红细胞裂解液、六孔板、大中小枪头盒
试剂准备：灭菌 PBS 缓冲液（加 0.09% FBS）、过滤消化液【胶原酶 IV 溶液（1mg/ml）、胶原酶 I 溶液（1mg/ml）、DNase I 溶液（0.2 mg/ml）】、1XFix/Perm 工作液、1X Perm 工作液、2%多聚甲醛
PS：以上步骤是因为我要培养细胞，所以要无菌，如果不进行培养或者分选的话可以不进行高压灭菌手术器械和过滤试剂。消化液的配方是组织特异性的，关于消化液大家可以参考倪老师的那篇帖子和这个网址http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/Tumor.html

二、样本制备
1、取材：将大鼠处死，泡在酒精中，放入超净台，取出皮下瘤，置于平皿中，放冰上。
Notes：制备实体瘤单细胞悬液，肿瘤取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，挑选活力较好的部位。
2、PBS 缓冲液洗涤，并剔除周围脂肪、结缔组织、血液等。
3、在六孔板中用眼科剪剪碎肿瘤组织，尽量剪的碎一些，用 PBS 缓冲液洗涤，转移至 50ml 离心管中。
4、视组织块量加入 6ml 的消化液，敷箱中消化 30min-60min，每隔一段时间轻轻振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
Notes：在消化过程中，如发现组织块已分散而失去块的形状，经摇动即可成为絮状悬液，则可取出少量液体在显微镜下观察，可见分散的单个细胞和少量的细胞团，可认为组织已消化充分。
5、消化完毕后，用细胞筛网过滤悬液 2 次，以除掉未充分消化的组织。
6、将过滤后悬液 800~1000rpm，离心 5-10min，弃上清液。
7、PBS 缓冲液 5ml，轻轻冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
8、每管视细胞量加入红细胞裂解液 1-3ml，冰上孵育 15min 后直接离心
9、视细胞量加入 1-2ml PBS，血球计数板计数。
10、将细胞调整到 10⁶/ml 左右，分在 5mlEP 管或流式管中
三、染死活
1、用 2ml 不含 FBS 的 PBS 洗涤，500g*5min 离心，弃上清；洗 2-3 次
Notes：我购买的死活染料不能加入 FBS，有些死活染料不用，可以看说明书确认下
2、每管加入 100ul 稀释 Fixable Viability Kit，避光室温孵育 15-30 min（配的时候关灯，加好后盖上冰盒盖）
Notes：死活染料染色的缓冲液中不应该使用含有 BSA 或者 FBS 的 PBS。
3、用 1ml 的 PBS 洗液洗涤 1 次，500g*5min 离心，弃上清；洗 2-3 次


以下各位老师根据需要选择表面、胞内、核内
四、细胞表面染色
1、分别加入表型抗体，冰上避光染色（配的时候关灯，加好后盖上冰盒盖）
2、加 1ml PBS 洗涤，500g*5min 离心，弃上清；洗 2-3 次
3、加入 2%多聚甲醛 200ul 固定过夜
Notes：之前请教过倪老师，1%-4%多聚甲醛都可以
4、加 1ml PBS 洗涤，500g*5min 离心，弃上清；
5、加入 500ul PBS 溶液重悬
6、上机检测（整个染色和上机过程注意避光）；

五、染核内抗体
1、 先根据需要对细胞表面标记进行染色，步骤如上
2、 最后一次洗涤后，弃上清（通常保留约 100 μL 残余体积），脉冲涡旋样品以完全离解沉淀。
3、 向每个管中加入 1 mL Foxp3 固定/破膜工作溶液并脉冲涡旋
Notes：因为我要染 FoxP3，所以直接买了这个 kit，如果没有这个试剂盒，可以用多聚甲醛固定
4、 2-8°C 或室温避光孵育 30-60 分钟。（小鼠样品可在 2-8°C 遮光孵育长达 18 小时）。
5、 每管加入 2 mL 1X 破膜液，在室温下 400-600 x g 离心样品 5 分钟。弃上清。
6、 [可选]重复第 5 步。
7、 在剩余体积的 1X 破膜液中重悬沉淀。通常为 100 μL。
8、 不洗涤，加入推荐量的荧光偶联抗体以检测核内抗原，并在冰上避光孵育50min。
Notes：因为破膜是可逆的，所以稀释抗体要在破膜液中，使得细胞在此环境中染色方可染上
9、 每管加入 2 mL 1X 破膜液，在室温下 400-600 x g 离心样品 5 分钟。 弃上清。
10、 重复第 10 步。
11、 将染色细胞重悬于 500ul 流式细胞术染色液中。
12、 通过流式细胞术分析样品。

六、染胞内抗体（我的胞内抗体是细胞因子需要刺激，不要刺激的老师可跳过刺激步骤）
1、 用 1ml PBS 洗涤，500g*5min 离心，弃上清；洗 2-3 次。
2、 于 37℃水浴锅中完全解冻激活试剂。
Notes：本产品对温度敏感，不建议反复冻融。
3、 在每毫升细胞培养基中加入激活试剂，用细胞培养基重悬细胞。建议细胞悬浮液为在 1-2×10⁶个细胞/mL 之间
4、 将细胞加入六孔板中，在 37℃的 CO2 培养箱中培养 6 小时。
5、 每个孔加入 500ul 胰酶消化细胞，放入敷箱中。
Notes：我培养的细胞基本上 4 个小时就贴壁了，所以我用了胰酶消化，但是可能胰酶会对表面 marker 有影响，不知道老师们有什么建议
6、 待细胞已经消化下来后加入 1ml 含有 FBS 的培养基，将细胞转移到 5ml EP管中，350g 离心 5 分钟，弃上清。
7、 加入 2mL 不含有 FBS 的 PBS 重悬，涡旋或者吹打混匀细胞，350g 离心 5 分钟，弃上清
8、 重复步骤 6。
9、 每管加入 100ul 稀释 Fixable Viability Kit，避光室温孵育 15-30 min
Notes：死活染料染色的缓冲液中不应该使用含有 BSA 或者 FBS 的 PBS。
10、 加 1ml PBS 洗涤，500g*5min 离心，弃上清；洗 2-3 次
11、 对细胞表面标记进行染色
12、 最后一次洗涤后，弃上清（通常保留约 100 μL 残余体积），脉冲涡旋样品以完全离解沉淀。
13、 向每个管中加入 1 mL Foxp3 固定/破膜工作溶液并脉冲涡旋
14、 2-8°C 或室温孵育 30-60 分钟。避光。（小鼠样品可在 2-8°C 遮光孵育长达 18 小时）。
15、 每管加入 2 mL 1X 破膜液，在室温下 400-600 x g 离心样品 5 分钟。弃上清。
16、 [可选]重复第 5 步。
17、 在剩余体积的 1X 破膜液中重悬沉淀。通常为 100 μL。
18、 不洗涤，加入推荐量的荧光偶联抗体以检测细胞内抗原，在冰上避光孵育 45-60 分钟。
19、 每管加入 2 mL 1X 破膜液，在室温下 400-600 x g 离心样品 5 分钟。弃上清。
20、 重复第 10 步。
21、 将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。
22、 通过流式细胞术分析样品。

@niwanmao 倪老师，附件已经上传了，麻烦您加入下白名单~

Reyna 发表于 2021-3-5 18:00
@niwanmao 倪老师，附件已经上传了，麻烦您加入下白名单~

我已经把顶楼帖子内容更新好了，可以正常发，没有提示异常。可能你前面粘进去之后，word文档带进去产生的一些代码导致的。

补充一点：
第四部分细胞表面染色，如果能及时检测，尽量不用第3小步，因为加入的多聚甲醛多多少少会影响某些标记的表达强度。

感谢分享这么详细的Protocol，给后来的新手会有很好启发。也欢迎其它做小鼠实验的高手们，一起补充、完善。

niwanmao 发表于 2021-3-5 19:57
我已经把顶楼帖子内容更新好了，可以正常发，没有提示异常。可能你前面粘进去之后，word文档带进去产生的 ...

麻烦倪老师您编辑了，感谢！

niwanmao 发表于 2021-3-5 20:32
补充一点：
第四部分细胞表面染色，如果能及时检测，尽量不用第3小步，因为加入的多聚甲醛多多少少会影响某 ...

确实，我的CD4分子总是染不好，所以能够不固定就上机是最好的