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流式细胞术做蛋白磷酸化检测的步骤和疑问

发布者: niwanmao | 发布时间: 2021-3-12 08:56| 查看数: 204| 评论数: 1|帖子模式

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蛋白质磷酸化是翻译后修饰(PTM)领域研究最深入的,三磷酸腺苷(ATP)中的磷酸基通过激酶共价连接到丝氨酸(~86%)、苏氨酸(~12%)或酪氨酸(~2%)上(也可以是其它氨基酸,相对少见),然后被磷酸酶去除。

磷酸化可以改变蛋白质的结构、功能和相互作用。因此,磷酸化在体内稳态和疾病的几乎所有细胞过程中都起着关键作用,包括信号转导、细胞周期、分化、增殖、代谢、活动和死亡。重要的是,不同残基上的磷酸化会导致不同的结果。例如,RAF1是MAPK通路的中心激酶,当它在丝氨酸(S)或苏氨酸(T)残基S259、S338、S340/341、T491或S494处磷酸化时会被活化,然而,如果在S289/296/301处磷酸化就会导致RAF1激酶活性的抑制。所以,了解磷酸化的特定位点和水平对于理解细胞信号和表型至关重要。

研究蛋白质磷酸化方法很多,有:十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Westernblot、流式细胞术、激酶测定法、酶联免疫法、质谱法等等,但实际上,这里面只有流式是唯一的单细胞磷酸化分析技术,而其它技术都是需要裂解细胞提取蛋白质分析,所以反映的是整个细胞群体蛋白质磷酸化状态的平均值,无法收集一个群体中单个细胞蛋白质磷酸化的信息,也没有能力追溯和识别磷酸化蛋白质相对应的细胞群体。

因此,如有可能,请大家尽量用流式来做磷酸化检测。

对于磷酸化流式,在此奉上一个磷酸化蛋白单染的Protocol,希望对大家有帮助。
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最新评论

macfano 发表于 2021-3-17 09:34:12
学习了,谢谢老师
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