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[细胞增殖] 请教刺激后PBMC(CFSE标记)应该如何圈门?

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 楼主| 发表于 2021-4-12 11:44:52 | 显示全部楼层 |阅读模式
2流星
本帖最后由 shunlifasci 于 2021-4-12 11:50 编辑

之前问过问题,因当时样本补偿调节不好,近期又重复了几次,结合自己的理解,再次提问。
关于增殖后的PBMC圈门。
     (1)实验方案:anti-CD3/cd28刺激人新鲜外周血分离的、CFSE标记的PBMC,培养5天。
     (2)实验分组:未刺激PBMC培养组、刺激PBMC组、加不同浓度药物的刺激PBMC组
     (3)实验目的:分析药物对T细胞(及亚型:CD4/CD8)增殖影响。
     (4)流式指标:因实验室CD4/死活染料荧光通道冲突,上机时染色了CD45/CD3/CD8抗体(cfse也占用了一个FITC通道)。
比如这张图,刺激后的PBMC,我应该如何圈门呢?
圈门1(方框/比例13.4)应该都是增殖的细胞,因为下一级图的CFSE结果是全增殖,明显手指峰。圈门3(不规则/比例2.99)应该都是未增殖的细胞,理由也是结合下一级图CFSE结果。
    但考虑我的刺激剂是TCR特异性,理论上刺激PBMC里的T细胞,通常情况下PBMC(FSC/SSC图)中的圈门3应该是淋巴细胞群体(T+B),结合我想研究的也是药物对T细胞增殖能力影响。我觉得应该是以2为圈门(比例17.7),更合适。
我不确定,想听大家指导?还有个问题,刺激剂是不是理论上让T细胞全部都能增殖呢,我感觉似乎有的CD3+群体也没有增殖?
(上传部分原始数据,请老师赐教,谢谢)

刺激后的PBMC

刺激后的PBMC

刺激PBMC 药物2培养后.fcs.zip

1.48 MB, 下载次数: 2

刺激PBMC 药物1培养后.fcs.zip

2.27 MB, 下载次数: 1

刺激PBMC培养后.fcs.zip

2.34 MB, 下载次数: 1

未刺激PBMC培养后.fcs.zip

1.13 MB, 下载次数: 2

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 楼主| 发表于 2021-4-12 11:48:52 | 显示全部楼层
我实验室没有做过刺激后PBMC圈门经验,所以不确定此图(FSC/SSC)圈门。但是,如果这一级别圈门不好,显然对后续CFSE增殖结果影响会很大。要是全选增殖的细胞群,后续CFSE结果>90%增殖。要是加上部分未增殖淋巴细胞,后续CFSE结果会下降不少。
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发表于 2021-4-12 16:09:28 | 显示全部楼层
这个图的横坐标是FSC?如果是的话,我个人倾向于2
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 楼主| 发表于 2021-4-12 17:36:11 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-4-12 16:09
这个图的横坐标是FSC?如果是的话,我个人倾向于2

是FSC的图,倪老师
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