流式杂谈

1068 niwanmao 楼主

最近几年,将细胞死亡方式进一步细分为:
I型(程序性细胞死亡,即凋亡)
II型(自噬性细胞死亡)
III型(程序性坏死)

也有另外一种方式将细胞死亡分为:
程序性细胞死亡(PCD,体内稳态性和胚胎性)
偶发细胞死亡( ACD,胀亡)
受调节的细胞死亡(RCD),包括细胞凋亡、坏死性凋亡、自噬、依赖性细胞死亡或过度的DNA损伤反应(简称DDR,如pH2AX磷酸H2AX组蛋白)引起的Poly(ADP-核糖)聚合酶(PARP)过度活化

这样的细分,对于理解细胞死亡的复杂性有很好的帮助。

但上述分类中,均未包括RIP1-(与受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1)依赖性凋亡或RIP1/RIP3/caspase-3细胞的现象,所以细胞死亡的的命名和定义还是应定期修正的。

虽然ACD和RCD的机制和检测方法不是非常完善,但在流式上还是可以进行检测的。如下图,利用Zombie、caspase-3、RIP-3、pH2AX、cleaved PARP等标记,可在流式上将细胞状态分为以下几类:

2021-05-12_21-52-02.jpg  (2021-5-13 08:10 上传)

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设门分析的示意图如下:

2021-05-13_07-34-50.jpg  (2021-5-13 08:10 上传)

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ACD和RCD途径。
(A)活细胞可以在药物处理后经历早期凋亡(EAPO)或胀亡、早期凋亡,最后到晚期凋亡(LAPO),然后在细胞降解后变为胀亡或坏死表型。 (B)活细胞在静息时可能表达RIP3+ve/caspase-3–ve,在坏死性凋亡时可能是RIP3high + ve / caspase-3–ve,或者是双阴性(DN)。 EAPO细胞会丢失RIP3,或者如果保留,则会经历RIP1依赖性细胞凋亡(RIP1-APO)。 EAPO细胞也可以RIP1+ve。 (C)质膜完整性的丧失或细胞死亡导致(B)中反映的细胞表型,细胞降解形成DN群体。 (B,C)活细胞和死细胞表型也可以表达pH2AX(DDR)或切割后的PARP(细胞凋亡),也可以最终同时表达两种蛋白质(D,E),从而导致两种情形:在活化caspase-3存在时使PARP的pH2AX过度活化; 在没有caspase-3的时候导致依赖性细胞死亡。
箭头指示的细胞群变化的方向。


参考文献:Vossenkamper A, Warnes G. Flow Cytometry Reveals the Nature of Oncotic Cells. Int J Mol Sci. 2019 Sep 6;20(18):4379. doi: 10.3390/ijms20184379. PMID: 31489916; PMCID: PMC6769836.
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有 11 条回复

2楼 13249133143 LV2

老师您好,请问凋亡、程序性坏死、焦亡、铁死亡、自噬性死亡 各自公认的流式标记是什么?

3楼 niwanmao 楼主

引用: 13249133143 发表于 2022-5-5 17:12
老师您好,请问凋亡、程序性坏死、焦亡、铁死亡、自噬性死亡 各自公认的流式标记是什么? ...

参见我们之前的文章:

居然还有焦亡?细胞死亡的形式和对应的流式检测汇总
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5431-1-1.html
(出处: 流式中文网)

4楼 13249133143 LV2

一种代表细胞marker,一种代表死亡蛋白,通过这样双染流式分析在组织中的占比。请问老师这样可行吗?科学吗?

5楼 13249133143 LV2

分析在组织中的死亡占比

6楼 niwanmao 楼主

引用: 13249133143 发表于 2022-5-6 17:19
一种代表细胞marker,一种代表死亡蛋白,通过这样双染流式分析在组织中的占比。请问老师这样可行吗?科学吗 ...

可以的,只是只选一种应该不够,至少要多几种标记,确保特异性。

7楼 13249133143 LV2

引用: niwanmao 发表于 2022-5-6 18:24
可以的,只是只选一种应该不够,至少要多几种标记,确保特异性。

几种标记可以分开染吗?我的抗体基本都要与二抗偶联发光,一般都只能做到双染

8楼 niwanmao 楼主

引用: 13249133143 发表于 2022-5-7 20:59
几种标记可以分开染吗?我的抗体基本都要与二抗偶联发光,一般都只能做到双染 ...

谁说二抗间标只有做双染的?直标的可以一起做啊。

9楼 13249133143 LV2

没有直标的抗体 目前我是想补个实验,通过流式分析组织里几种细胞的死亡情况。通过一些marker标记细胞,再标记死亡核心分子,双染流式分析其中的占比。这些抗体都是需要偶联二抗发光,跟免疫荧光一样,甚至一些抗体没有流式的应用,只有IF。 老师评价一下这样的操作可行性怎么样

10楼 niwanmao 楼主

引用: 13249133143 发表于 2022-5-8 15:41
没有直标的抗体 目前我是想补个实验,通过流式分析组织里几种细胞的死亡情况。通过一些marker标记细 ...

你指的是区分细胞群体的标记没有直标?那很简单,买无标记的抗体,再买一个标记试剂盒,自己做成直标抗体即可。
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