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小鼠辅助T细胞体外分化详细步骤,包括诱导培养基的配方

发布者: niwanmao | 发布时间: 2021-7-8 13:48| 查看数: 225| 评论数: 1|帖子模式

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在抗原刺激下,CD4+辅助T细胞(Th)遵循不同的发育途径,获得专门的特性和效应功能。传统上认为Th细胞会分化为Th1和Th2细胞亚群。Th1细胞是为了加强对细胞内病原体(如细胞内细菌、病毒和一些原生动物)的清除,其特点是产生IFNγ,这是一种有效的细胞介导的免疫激活剂;Th2细胞是为了加强对寄生虫感染(如螺旋体)的清除,其特点是产生IL-4、IL-5和IL-13,它们是B细胞免疫球蛋白(Ig)E产生、嗜酸性粒细胞招募和粘膜驱逐机制(粘液产生和蠕动减弱)的有效激活剂。

2005年前后Harrington等人发现了一种新的辅助T细胞亚群,这类辅助T能够产生IL-17,被命名为Th17,是不同于Th1或Th2细胞的一个亚群(Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, Turner H, Murphy TL, Murphy KM et al (2005) Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol 6(11):1123–1132) 。Th17细胞分泌一组独特的免疫调节细胞因子,包括IL-17A、IL-17F、IL-22和IL-21。这些细胞因子在炎症和自身免疫以及消除细胞外细菌和真菌病原体方面共同发挥作用。小鼠自身免疫模型,如实验性自身免疫性脑炎(EAE)和胶原蛋白诱导的关节炎(CIA),已被证明依赖于Th17细胞。



## 分离初始CD4+T
1. 从6-8周龄小鼠的脾脏和淋巴结制备细胞悬液,重悬在5毫升无血清RPMI1640培养基中。一只小鼠通常可产生约5×10E7的初始CD4+T细胞。
2. 加入10mL红细胞裂解液,倒置5次,然后在室温下以800×g离心4分钟。
3. 用5毫升的MACS缓冲液重悬细胞,然后在室温下以800×g离心4分钟。
4. 去上清,再重复一次步骤3。
5. 去除上清,用100μL的MACS缓冲液重悬细胞,并加入生物素标记的CD8α、B220、CD25、CD11b、CD11c、CD49b和TER-119抗体的混合物,用量为每1×10E7个细胞的浓度为1μg/ml。将细胞在冰上孵育15分钟。
6. 在室温下以800×g离心1分钟,然后去除上清液。
7. 用1毫升的MACS缓冲液重悬细胞,然后在室温下以800×g离心1分钟。
8. 去除上清,然后用100μL的MACS缓冲液重悬细胞,以每1×10E7个细胞加入10μL/mL的浓度用链霉蛋白微球。将细胞在冰上孵育15分钟。
9. 在室温下以800×g离心1分钟,然后去除上清。
10. 用1毫升的MACS缓冲液重悬细胞,然后在室温下以800×g离心1分钟。
11. 去除上清,然后用1毫升的MACS缓冲液重新悬浮细胞。
12. 根据厂家的步骤,使用大型depletion column分离抗体结合的和未结合的细胞。流出的部分含有一部分初始CD4+T细胞。
13. 流出物在室温下以800×g离心4分钟。
14. 去除上清,然后100μL的MACS缓冲液重悬细胞,加入CD62L微球,每1×10 7个细胞中浓度为100μL/mL。将细胞在冰上孵育15分钟。
15. 在室温下以800×g离心1分钟,然后去除上清。
16. 用1毫升的MACS缓冲液重悬细胞,然后在室温下以800×g离心1分钟。
17. 去除上清,然后用1毫升的MACS缓冲液重新悬浮细胞。
18. 根据厂家的步骤,使用大型分离柱分离CD62L微球结合和未结合的细胞。留在柱子中的部分含有初始CD4+T细胞。用5毫升的MACS缓冲液冲洗柱子中结合的细胞,这部分洗脱液就是初始CD4+T细胞,一般CD4+CD25-CD62L hi细胞的纯度大于95%。


## Th1细胞的分化
1. 前一天,事先制备一个包被抗CD3ε抗体的培养板,方法很简单,就是在24孔培养板中,每孔加入250μL抗CD3ε抗体(2μg/mL,用PBS稀释)。
2. 用500μL Th1分化培养基,加入4×105个初始CD4+T细胞。
3. 在包被抗CD3ε的24孔培养板的单孔中培养细胞。
4. 在37℃的5%CO 2培养箱中培养细胞96小时。

## Th2、Th17、iTreg细胞的分化
步骤同Th1细胞的分化,唯一不同的是,将其中的Th1分化培养基,改成Th2、Th17、iTreg的分化培养基。

## Th1、Th2、Th17、iTreg分化培养基配方
### Th1分化培养基
RPMI1640中加入0.5μg/mL抗CD28、1μg/mL抗IL-4抗体、5ng/mL IL-2、10ng/mL IL-12、10 %FBS、非必需氨基酸、抗生素和55 μM β-巯基乙醇。

### Th2分化培养基
RPMI1640中加入0.5μg/mL抗CD28,1μg/mL抗IFN-γ、5ng/mL IL-2、10ng/mL IL-4、10 % FBS、非必需氨基酸、抗生素和55μM β-巯基乙醇。

### Th17分化培养基
RPMI1640中加入0.5μg/mL抗CD28、1μg/mL抗IFN-γ、1μg/mL抗IL-2、1μg/mL抗IL-4、20ng/mL人IL-6、1ng/mL TGF-β1、10 % FBS、非必需氨基酸、抗生素和55 μM β-巯基乙醇。

### iTreg分化培养基
RPMI1640中加入0.5 μg/mL抗CD28、1μg/mL抗IFN-γ、1μg/mL抗IL-4抗体、2ng/mL TGF-β1、10 % FBS、非必需氨基酸、抗生素和55 μM β-巯基乙醇。


信源:Sekiya T, Yoshimura A. In Vitro Th Differentiation Protocol. Methods Mol Biol. 2016;1344:183-91. doi: 10.1007/978-1-4939-2966-5_10. PMID: 26520124.

最新评论

魂断蓝桥 发表于 2021-7-12 09:20:59
楼主你好:分离CD4+T Cell,能不能直接用带磁珠的CD4的抗体来分离,后期磁珠对细胞的极化影响大吗?
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