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OMIP-070: 基于NKp46的27色方案,肿瘤组织NK功能和表型区分

发布者: niwanmao | 发布时间: 2021-7-11 19:53| 查看数: 153| 评论数: 0|帖子模式

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自然杀伤(NK)细胞是20世纪70年代首次被发现的,具备无需事先免疫就能消除肿瘤细胞的能力,因此有人提出NK细胞具有持续的预防作用,可以消除恶性转化的细胞,有助于控制血液恶性肿瘤或肿瘤转移。除了发挥直接的细胞毒性外,NK细胞还能产生细胞因子和趋化因子,调节局部微环境并招募更多的免疫细胞。这些数据共同表明,NK细胞可以对实体瘤的抗肿瘤免疫反应做出重大作用。

然而,我们还是需要对肿瘤内的NK细胞进行更深入的分析,以进一步解读NK细胞如何影响肿瘤生长。值得注意的是,多项研究表明,人类的肿瘤进展和结果与肿瘤部位的NK细胞的存在有关,这突出表明这些细胞对实体瘤免疫治疗方法的发展有意义。

研究从肿瘤中分离出来的人类NK细胞的一个障碍是,通常从活检或肿瘤切除中获得的组织数量有限。因此,最重要的是在单细胞水平上从肿瘤样本中提取尽可能多的信息,同时尽量减少样本的进一步损失。

详细分析浸润性NK细胞的第一个关键步骤是获得单细胞悬液,使其具有较高的存活率和最小的细胞碎片,并保留检测关键细胞表面抗原。在这里,推荐使用一种结合了II型胶原蛋白酶和DNase的成熟消化方法。这种基于II型胶原蛋白酶的方案已经使用了近20年,在处理人体粘膜组织时,能产生很好比例的存活粘膜单核细胞(Leelatian N, Doxie DB, Greenplate AR, Sinnaeve J, Ihrie RA, Irish JM. Preparing viable single cells from human tissue and tumors for cytomic analysis. Curr Protoc Mol Biol 2017;118:25C 1 1–25C 1 23.)。

第二个关键步骤是从细胞悬液中提取尽可能多的信息。为此,多参数流式细胞仪特别适合。事实上,虽然在染色和洗涤过程中会出现细胞损失,但在采集过程中损失却很小,目前基于荧光的标准流式细胞仪的细胞传输效率大于95%。

在此,Marie Frutoso等人为我们介绍了一个27个参数的流式方案的开发和验证,该方案适合于定义从人类肿瘤组织中分离出来的NK细胞的表型和活化状态。

方案
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设门步骤
为了识别肿瘤组织中的NK细胞,我们采用了下图A所演示的设门策略,即NK=“活的造血细胞(Dead-, CD45+)、非B细胞(CD19-)、非单核细胞(CD14-)、非T细胞(CD3-)、非固有淋巴细胞(ILC)(CD127-)和HLA-DR-细胞”。这种设门策略是为了确保其他免疫群体,如B细胞、T细胞和单核细胞,也能被统计出来,并且尽可能保证NK群体的完整性。值得注意的是,HLA-DR是淋巴细胞免疫活化的常见替代物,据报道它在一部分NK细胞中表达,不过,HLA-DR+细胞的CD16表达也可能指向非经典的CD14-单核细胞。所以以后还需要进一步探索HLA-DR设门的替代性。
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