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DNA染色选择多,看一下最常用的PI和Hoechst33342染色步骤

发布者: niwanmao | 发布时间: 2021-8-8 16:30| 查看数: 259| 评论数: 0|帖子模式

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细胞的DNA可以被多种染料标记,例如:
- 碘化丙啶(PI)
- 溴化乙锭
- Hoechst 染料,主要是 Hoechst 33342 和 Hoechst 33258
- 光神霉素(Mithramycin)
- DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)
- 7-氨基放线菌素D(7-AAD)
- To-Pro-3
- 色霉素(Chromomycin)

最常用的 DNA 染料是碘化丙啶 (PI),可嵌入 DNA 双螺旋中并发出强烈的红色荧光(最大发射波长 637nm)。它的优点是可被 488nm 光激发,可用于最常见的台式流式细胞仪。然而,PI染色需要固定或透化细胞,因此细胞无法存活。 PI 也会和双链 RNA 结合,所以染色时需用RNA酶去除。

如果需要保证细胞是活的,或者需要同时做表面标记或胞内标记(虽然PI也能用多聚甲醛固定和皂素破膜做,但难度较高),可选择 Hoechst 33342,它与 DNA 中富含 AT 的区域结合,无需固定即可进入活细胞,因此细胞可以在染色之后继续培养或进行后续操作。这种方法的缺点是 Hoechst 33342 通过紫外光激发,因此不能用于大多数台式流式细胞仪。

## PI染色检测细胞周期的染色步骤
I.材料
    1、70% 乙醇,保存在– 20度
    2、DNA 染色液(10ml,新鲜配制)的组成:
           ①Triton–X 100   10uL
           ②1mg/ml碘化丙碇   200uL
           ③DNase-free RNase     2mg
           ④PBS      9.79ml
     注:1mg/ml的PI储存液是由1 mg PI溶于1 ml蒸馏水中配制而成,可在0℃到4℃保存数月。
            如果RNase不是DNase-free,可将2 mg RNase A在1 ml蒸馏水中煮沸5分钟。
II.步骤
1.  取1x106 细胞/管,PBS洗涤两次,每次250g离心5分钟。
2.  尽可能完全去除上清,加入1ml于-20℃ 预冷的70%乙醇,注意,要边振荡边加。
3.  标本保存于-20℃,直至要进行DNA染色(可保存数周至数月)
4.  染色当天取出标本,于250 x g 离心5分钟,尽可能完全去除上清,然后再用PBS洗涤1-2次,离心速度250g×5分钟。
5.  加入1 ml  DNA染色液,充分振荡,染色15分钟即可上机检测。

以上是比较快速的步骤您也可以先用RNAse作用30分钟(常温或37度均可,但需注意有些细胞可能不适合,需对比测试),然后再用染色液孵育15分钟。
这几种作用方式结果无差别:https://www.flowcyto.cn/bbs/foru ... &ptid=1331&pid=4794

## Hoechst 33342检测细胞周期的染色步骤
1. 在 37°C 下用 Hoechst 33342孵育细胞 10-60 分钟。 使用的 Hoechst 浓度必须预先优化,因为不同细胞的最佳浓度会有所不同,一般在 5-20µg/ml 的范围内。
2. 孵育完毕,以 1000 转/分的速度离心5分钟。 在 PBS 中洗涤2次。 必要时,可加入低浓度的PI孵育1分钟排除死细胞。
3. 上机,收集 390nm 和 480nm 波长之间的 Hoechst 荧光。


## 分析
无论是PI染色还是Hoechst 33342染色,均需事先进行粘连体排除,详见:
PI检测细胞周期时如何排除粘连体
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2164-1-1.html
(出处: 流式中文网)

否则,就容易发生heybibna 站友那样的误解:
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-9264-1-1.html
(出处: 流式中文网)

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