细胞周期分析

蒸冬薯

                               
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从log axis 切换到linear axis，细胞周期就没有双峰了，请是什么问题啊？

wxd

初步看了一下数据，发现在FSC-A/SSC-A坐标系中，是有明显的区别于细胞碎片的群体的。说明细胞形态大致完整。但是看荧光通道，因为不知道用的什么染料，所以都看了一下，确实没有看到细胞周期的双峰。因为信息有限，所以没发现问题所在，如果用的是PI，建议从以下几点开始排查：1. 固定剂是否用的是多聚甲醛之类的变性剂，细胞周期建议用70%乙醇（脱水剂）；2. 如果是70%乙醇固定，是否是-20℃固定2h，经验中，这个固定方式不如4℃过夜固定后染色效果好；3. 染色时是不是没有加RNase；4. PI染色后需要在24 h内检测完毕，不能长时间放置；5. PI染色后不需要清洗，清洗会显著降低荧光强度。
如果用的不是PI，还需要排查1. 所用染料是否和染色方法匹配（如只能染死细胞的染料，染色前需要先固定细胞）；2. 染料染色方法是否合适（如：DAPI可以用来染活细胞，但有些细胞需要在37℃孵育30 min甚至更长时间才能取得良好的染色效果）。

蒸冬薯

wxd 发表于 2021-9-2 17:22
初步看了一下数据，发现在FSC-A/SSC-A坐标系中，是有明显的区别于细胞碎片的群体的。说明细胞形态大致完整 ...

用的PI ,70%乙醇4℃固定，PI用的是BD 551396 应该是含RNase。染色后立即上机检测，问题可能出在我PI染色后用PBS清洗了一遍细胞？

wxd

有这个可能。建议你用Hela等增殖比较快（容易检测到两个峰）的细胞，染色完成后不要清洗，再试一下，排除一下细胞的问题和操作的问题。另外注意离心转速，我们在操作时，一般用水平转子，800 rpm，角转子用1000 rpm，都是离心3 min。

蒸冬薯

wxd 发表于 2021-9-3 09:27
有这个可能。建议你用Hela等增殖比较快（容易检测到两个峰）的细胞，染色完成后不要清洗，再试一下，排除一 ...

非常感谢，我再重复一下，这应该与电压大小没有关系吧，非常不理解为什么log 轴是正常的

niwanmao

蒸冬薯 发表于 2021-9-4 10:27
非常感谢，我再重复一下，这应该与电压大小没有关系吧，非常不理解为什么log 轴是正常的 ...

看了下数据，你们用的是Attune NxT机器，所以数据格式会很怪。通过放大才好不容易把数据调出来，线性下面是有2倍左右关系的，但是拟合失败，从拟合图上很明显看的出来，是电压过低引起荧光强度不达标，所以模型无法拟合。

蒸冬薯

niwanmao 发表于 2021-9-4 11:23
看了下数据，你们用的是Attune NxT机器，所以数据格式会很怪。通过放大才好不容易把数据调出来，线性下面 ...

非常感谢，我们实验室的确用的是赛默飞这台，我是用阴性对照调了BL2通道的电压（有看到说细胞周期不用阴性对照），我下次上机把BL2 通道改为线性显示再调电压