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流式用于细胞动力学监测的挑战

发布者: niwanmao | 发布时间: 2021-11-16 20:46| 查看数: 148| 评论数: 0|帖子模式

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流式细胞术很适合用于监测细胞疗法中的细胞动力学,因为它能够分析大量细胞并识别稀有细胞群。但在监测时,会存在一些挑战。

阳性对照样本
由于正常人血细胞中缺乏特定标志物(例如 CAR、特定TCR 等),故可能需要表达这些标志物的稳转细胞系。对于细胞疗法(如 CAR-T 细胞),必须采购表达该标志物的转基因细胞系,并将其添加到正常血液中进行测试。

获取表达 CAR 的细胞是主要挑战,尤其是对于自体 CAR-T 细胞而言,其中 CAR-T 细胞是从患者的 T 细胞中产生的。不过,同种异体 CAR-T 细胞可用于开发检测。

通常,与 CAR 转染的细胞系 (Jurkat) 相比,CAR 转染健康供者 T 细胞是更好的选择,因为:

•CAR-T 转染正常 T 细胞与患者 CAR-T 细胞的所有标记相似,仅缺少异常细胞群。而CAR 转染细胞系虽然比健康供者 T 细胞的 CAR 转导更容易建立,但细胞系不表达 T 细胞标志物,如 CD3、CD4 和 CD8。
•CAR转染的T细胞表达 T 细胞标记,可用于建立设门策略和验证。

流式方案设计
方案设计对于准确确定细胞产品至关重要。可用于检测 CAR-T 细胞的商业试剂有限。当没有商业试剂时,需要定制开发CAR的检测抗体。这些定制开发的试剂需明确其特异性、同种型、纯度、浓度、荧光与蛋白质的比率和稳定性。抗独特型抗体是用于检测 CAR-T 细胞的最常用试剂,因为它们具有高亲和力和低非特异性结合。当靶标主要在肿瘤细胞上表达时,也使用染料偶联的靶标融合蛋白。其他用于检测 CAR-T 细胞的试剂包括 protein-L 和 anti-tag mAb。

设计检测方案的时候,需要重视荧光补偿,通过调整荧光素搭配(弱表达的标记用强荧光素、高表达的标记用弱荧光素),胞内染色会增加方案和操作的复杂性,随着方案中颜色数量的增加,补偿和方案设计的合理性,将对在开发过程中分析细胞疗法的功效以及该分析的性能产生重大影响。

方案设计完成后,必须进行严格的开发测试,以确保方案能够准确识别所有群体,并表达所有标记。

定量下限(LLOQ)
多参数流式细胞术检测中的 LLOQ 通常是开发功能性药代动力学检测的限制因素,尤其当目标群体(CAR-T 细胞)的细胞数非常少时。

通常,大家使用 100–200 μl 的外周全血样本或骨髓,如果需要更多事件,可增加至500 μl,甚至1 到 10 ml,先溶血再离心浓缩,可获得足够的罕见事件。

预染色样品稳定性
样品稳定性是多参数流式细胞术需要克服的最具挑战性的问题。

流式细胞术可以在几种不同的组织类型和各种储存条件下进行,包括全血、裂解全血、PBMC、骨髓和脑脊液。虽然冷冻 PBMC 或冷冻裂解全血稳定性还可以,但常规的全血在抽血后只能稳定保存2~3天,所以有必要进行一定的保护延长保存时间。

(注:流式中文网原研的FlowGuard® 流式专用细胞保存液可将样本保存时间延长至2周以上,如有意向可联系产品代理商 深圳市益希医疗器械有限公司,地址:深圳市福田区金田路3037号金中环商务大厦主楼2109,联系人:杨婉瑜,电话:13823307890,邮箱:wannieyang88@163.com

流式细胞仪试剂
除了样品稳定性外,还必须考虑抗体和预混抗体的稳定性。

每种抗体都有不同的失效日期,并且因不同的标记、荧光素不同而有不同的储存和处理方法。在大多数多参数流式细胞术检测中,大家都喜欢用预混抗体去做,节省加抗体的时间,但是由于不同的荧光素混合在一起,可能会发生相互作用,影响抗体稳定性,所以必须充分测试预混抗体的稳定时间,确保预混抗体的性能。

流式细胞术数据分析
多参数流式细胞术分析需要经过严格流式细胞术培训的科学家进行采集和分析。需要了解预期的细胞群体和每个标记的表达意义才能准确区分群体。胞内染色会改变白细胞的前向散射和侧向散射光,患者样本表达的某些标记会比正常强或弱,所以没有足够的知识积累,就无法准确分析。

荧光减一 (FMO) 染色可以帮助大家进行正确的设门,识别不同的标记物和细胞群体。虽然 FMO 通常等同于同型对照,但仍必须在完整染色的背景下进行解释,以确保正确的设门。

总之,基于流式细胞术的药代动力学(PK)检测是细胞治疗的极佳选择,可多次快速监测细胞产品的数量变化,只要控制好上述的挑战因素,PK检测就能做好。

信源:Lang K, Matys K, Bennett P, Kakkanaiah VN. Flow cytometry and pharmacokinetics. Bioanalysis. 2021 Nov;13(21):1645-1651. doi: 10.4155/bio-2021-0140. Epub 2021 Oct 18. PMID: 34657485.

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