基础问题

949 smmthlun678 LV2

悬赏 5 流星 已解决
各位大佬好,最近做实验遇到了一个问题,我现在在做的实验中需要对软骨细胞进行凋亡的检测,用的是Annexin v/pi的方法,现在出现了一个问题,我在做流式之前都会对搜集的细胞进行一个台盼蓝染色计数,我发现台盼蓝计数的细胞活率都超过了95,但是上机后PI阳性的比例非常高,达到16-17%,这跟我台盼蓝计数结果产生了矛盾,而且这个PI阳性贯穿了所有的组,无论是阴性对照、单染还是双染,甚至有一次我拿了完全没做过实验的软骨细胞,PI阳性也是这么高,有大佬知道这是怎么一回事吗?希望有大佬能看到并解答疑问,万分感谢!

                               
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liuruiluna 查看完整内容

作为死活染料,PI 不能染那么久的, 混悬好了 静置5-10分钟,不洗
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有 11 条回复

2楼 liuruiluna LV4

引用: smmthlun678 发表于 2021-11-27 20:23
PI染色是在4℃下染了30min

作为死活染料,PI 不能染那么久的,  混悬好了 静置5-10分钟,不洗

3楼 smmthlun678 楼主

0PM21W~LD%{2`)V54JAQYFI.png  (2021-11-26 10:44 上传)

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补一个图,刚才图没发出来

4楼 liuruiluna LV4

PI 染了多久呢

5楼 niwanmao 管理组

引用: smmthlun678 发表于 2021-11-26 10:45
补一个图,刚才图没发出来

你的操作步骤、试剂盒来源,能否分别解释一下?

6楼 Yuck LV4

染过了?

7楼 smmthlun678 楼主

引用: liuruiluna 发表于 2021-11-26 18:46
PI 染了多久呢

PI染色是在4℃下染了30min

8楼 smmthlun678 楼主

引用: niwanmao 发表于 2021-11-26 20:37
你的操作步骤、试剂盒来源,能否分别解释一下?

步骤如下:
1、消化:吸取上清培养基到离心管,然后加入0.25X含EDTA的胰酶250ul/孔(12孔板),消化2min后用生理盐水终止消化,然后把细胞吹打下来加入离心管,1200r/min,离心沉淀10min
2、计数:弃上清液,然后用1ml生理盐水重悬,取10ul悬液用台盼蓝计数
3、流式:再次1200r/min离心洗涤5min,最后制作成200ul的悬液,分四组(对照,av单染,pi单染,双染),每组50ul,分别加入抗体(抗体每种加2ul),孵育30min后加入多聚甲醛,上机。
试剂盒是biolegend的,由于是借用别人的实验室的,多以具体包装我找不到了,给我试剂的人说是没有过期。

9楼 smmthlun678 楼主

引用: Yuck 发表于 2021-11-27 13:33
染过了?

不确定,我下次试试减少孵育时间

10楼 liuruiluna LV4

本帖最后由 liuruiluna 于 2021-11-29 09:52 编辑
引用: smmthlun678 发表于 2021-11-27 20:39
步骤如下:
1、消化:吸取上清培养基到离心管,然后加入0.25X含EDTA的胰酶250ul/孔(12孔板),消化2min ...

1)做凋亡,不能用含有EDTA的胰酶
2)不做固定,不要把凋亡和流式抗体染色等同

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