在设计多色流式方案时，会设计到给A抗原分配什么荧光素？B抗原分配什么荧光素？以前4色，还是比较好选，现在10色、20色、30色，可就头疼了，选错了，弱表达的抗原跑不出来，或者荧光渗漏过大导致补偿调不好，或者Spreading Error（扩散误差）过大导致鱼尾状分布，很难设门，不好看甚至结果可能不准确。

所以，要设计一个合理的多色方案，不是一件容易的事，但是我们还是有标准的步骤的，大家只要按照此步骤，问题不大，建议测试时选择小包装的产品，测试步骤完成后，再订购大包装的抗体。

步骤
1. 根据实验目的，给目标细胞群(例如CD8+T细胞)定义表达特点。

2. 列出分析目标群体所必需的谱系标记（例如分析CD8+T细胞，至少需要CD3、CD8和CD45）。

3. 列出所有感兴趣的目标标记，并将预期的表达模式和抗原密度分类为低、中和高表达(如果已知的话)。

4. 订购试用装或小包装抗体，做各个荧光染料的单染对照（可用确认表达该标记的细胞，也可用荧光补偿微球），在机器上跑完之后，在FlowJo或其他流式分析软件中计算SSM（溢出扩散矩阵）。

例如下图就是一个22 色实验的SSM示例，大家平时也可作为大致的参考（点击图片放大查看高清版本）：


5. 在SSM中，寻找三个最大值，将这三个通道相应的荧光染料分配给互斥的抗原，即不在同一细胞上表达的抗原。例如在上面的SSM中，最大值是BUV563渗漏到YG-586 PE检测器（22.3）。

6. 计算SSM中的**行**总和。行总和的荧光素，扩散误差最小，这种荧光素应该分配给谱系标记，例如本次试验靶细胞所需的谱系标记CD3和CD8，用于准确圈中靶细胞且不会对其它通道造成较大影响。在上面示例的SSM中，扩散误差最小的荧光素是BV421 和 BUV395。

7. 计算SSM中的**列**总和。

列总和最小的检测器接收到的扩散误差最少，所以这些检测器适用于弱表达或未知表达的目标标记。在上面示例的SSM中，最不容易被影响的检测器是B-515 和 V-510 检测器。当然，如果有可能，尽量给这些目标抗原分配较亮的荧光染料。        

列总和最大的检测器会接收更多的扩散误差，如上面示例SSM中，的YG586 和 YG-610 检测器。不过，也需要注意，如果只是其中一种荧光素导致该检测器扩散误差过大，例如示例SSM中的BUV563 对 YG-586 检测器的贡献，如果该荧光素不用，那么YG-586检测器还是相当不错的。

8. 按照上面的方法确定下最终的荧光素搭配方案之后，订购大包装，开始做包括所有相关FMO对照的正式实验。


信源：Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition). Eur J Immunol. 2021;51(12):2708-3145. doi:10.1002/eji.202170126