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人CD4+T 细胞细胞因子分泌能力,如何刺激比较好?

发布者: niwanmao | 发布时间: 2022-4-14 20:30| 查看数: 201| 评论数: 0|帖子模式

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除了趋化因子受体表达和归巢能力之外,Th 亚群还根据其产生特定细胞因子的能力进行定义。
- Th1细胞的特征在于IFN-γ;
- Th2细胞的特征在于IL-4、IL-5 和IL13;
- Th17细胞的特征在于IL-17A 以及 17F、IL-22 和 IL-26。
- Th1*细胞尽管具有介于 Th1 和 Th17 之间的中间表型,但产生的细胞因子主要是IFN-γ,仅分泌有限的 IL-17A。

由于细胞因子不是预先形成或储存在颗粒中,因此它们的水平在从血液中离体分离的静息细胞中通常很低甚至为零。因此,需要对从血液中富集的 CD4 + T 细胞群进行体外激活,以分析其细胞因子表达。用佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸 (PMA) 和离子霉素 (Iono) 进行刺激是一种评估 T 细胞细胞因子产生能力极为方便的方法,无需顾及抗原特异性如何。 内质网内细胞因子需通过蛋白质转运抑制剂使其积累在细胞内而不会被分泌出去。两种最常用的抑制剂是莫能菌素 (MN) 和布雷非菌素 A (BFA)。

需要仔细考虑蛋白质转运抑制剂的选择,因为它们在刺激后可能对表面和细胞内蛋白质表达产生不同的影响。例如,BFA 将有助于最大限度地捕获 TNF-α、IFN-γ 和 IL-17A,但会阻止某些分子的表面表达,例如 T 细胞活化标志物 CD69。在 T 细胞的多克隆刺激后,不同细胞因子可能会具有不同的动力学。对于大多数细胞因子,4-6 小时的刺激和积累是最佳的。然而,在某些情况下,例如由记忆/辅助 T 细胞产生的 IL-10,其产生动力学相对缓慢,并且可能需要至少 24 小时的刺激和不同的刺激策略才行。值得注意的是,IL-10 在标准 PMA 和 Iono 刺激后由效应和调节性 T 细胞迅速分泌。

由于 MN 和 BFA 都具有中等毒性,因此应限制受刺激细胞的暴露时间。因此,一般情况下,可以在最后 2-4 小时添加 MN 和 BFA,而对于长时间的刺激(如24小时刺激),可以在最后 4-6 小时添加,以优化慢动力学细胞因子的积累。

更为详细的刺激方法(包括试剂、浓度等),请参见[[流式protocol] PMA/离子霉素刺激检测Th1和Th17,含CD4下调机制和解决办法](https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6801-1-1.html)

如下图,图A左侧是未刺激样本,图A右侧是用PMA/离子霉素刺激5小时(最后2.5小时加入BFA)后记忆Th的IFN-γ 和 IL-17A表达。 图B是刺激后 总CD4+记忆 T 细胞表达 IFN-γ 和/或 IL-4、IL-17A 和/或 IL-22,以及 IL-10 和/或 GM-CSF。图C是根据趋化因子设门分选富集出Th1、Th2 和 Th17 细胞后,体外刺激检测它们的IFN-γ、IL-4 和 IL-17A 的表达。
20220414_201503.png


编译自:Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition). Eur J Immunol. 2021;51(12):2708-3145. doi:10.1002/eji.202170126

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