流式杂谈

465 niwanmao 楼主

大量研究表明免疫细胞,特别是巨噬细胞在中枢神经系统(CNS)病理过程中的作用。

中枢神经系统有两种主要的巨噬细胞:(i)小胶质细胞,是中枢神经系统的常驻巨噬细胞,在胚胎发育过程中来源于卵黄囊前体细胞;(ii)单核细胞来源的巨噬细胞(MDM),在疾病期间可以渗透到中枢神经系统,来自骨髓前体细胞。

根据所研究的病理,每个巨噬细胞亚群的作用不同。此外,对于这些巨噬细胞亚群的组织学标志物或区分标准还没有达成共识。

然而,Martin等人通过流式细胞术分析CD11b和CD45标记的表达水平,可以区分出小胶质细胞(CD11b+CD45med)和MDM(CD11b+CD45High)。通过密度梯度离心法和流式细胞术分析可以用来区分这些CNS不同的巨噬细胞亚群,并研究这些细胞表达的几个感兴趣的标记。这有助于进一步了解巨噬细胞在小鼠神经系统疾病模型中的作用,也可以用于评估药物对这些细胞的影响。

我们先来看最终的分析结果,A-C是设门逻辑,分别是排除粘连体、圈单个核细胞区域排除碎片、根据CD11b和CD45标记的表达水平识别小胶质细胞和MDM(D图是同型对照,了解背景); E-G是对每个巨噬细胞亚群的其他表达标记Tmem119、CX3CR1、CCR2进行了分析,小胶质细胞表达CX3CR1而不表达CCR2标记,Tem119是小胶质细胞的特异性标志物,故很明显,CD11b+CD45med群体是小胶质细胞,而MDM则恰好呈相反的表达模式,所以CD11b+CD45high的群体是MDM。图H是在没有密度梯度离心的情况下,由于存在许多细胞和髓鞘碎片,无法在FSC-A与SSC-A的点图中定义巨噬细胞亚群。图I和图J则对比显示了破膜对FSC和SSC的影响。图K显示的是密度梯度离心后,85-95%的细胞是活的。图L至图N是在单个样本中分离大脑和脊髓细胞后,或单独从脑或脊髓中分离出小胶质细胞的得率情况。最后,图O到图R则显示的是对Tmem119的染色对比,说明必须固定破膜后,才能染上。

jove-124-55781-2.jpg  (2022-4-19 12:05 上传)

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详细实验步骤,包括消化液的配方,请参见原文信源:Martin, Elodie et al. “Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry.” Journal of visualized experiments : JoVE ,124 55781. 22 Jun. 2017, doi:10.3791/55781



引用: 在流式中文网公众号上,两位站友反馈如下,供大家参考:

2022-04-20_15-13-17.jpg  (2022-4-20 15:22 上传)

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有 8 条回复

2楼 NeoJ LV2

本帖最后由 NeoJ 于 2022-4-24 09:47 编辑

请问楼主,CD45+CD11b-的那群细胞可能是什么呢?疑惑……

3楼 niwanmao 楼主

引用: NeoJ 发表于 2022-4-24 09:46
请问楼主,CD45+CD11b-的那群细胞可能是什么呢?疑惑……

淋巴细胞

4楼 facetodog LV3

确定这不是死细胞吗

5楼 niwanmao 楼主

引用: facetodog 发表于 2022-6-14 09:01
确定这不是死细胞吗

你指的是哪群?

6楼 facetodog LV3

引用: niwanmao 发表于 2022-6-14 09:09
你指的是哪群?

红的那群 CD45MED

7楼 niwanmao 楼主

引用: facetodog 发表于 2022-6-15 09:17
红的那群 CD45MED

可能你是觉得其位于对角线上,是吧?

这个是恰好因为双阳造成这样的分布,实际上isotype可说明问题,如果是死细胞,isotype也会位于相近的位置形成火箭状分布,并且FSC/SSC也可结合起来判断证实其不是死细胞。

8楼 woiamtt LV2

请问CD11b+/CD45high和CD11b+/CD45[b]low,到底哪个才是小胶质细胞?我看的文献有的是相反的。

9楼 niwanmao 楼主

引用: woiamtt 发表于 2022-7-3 11:15
请问CD11b+/CD45high和CD11b+/CD45low,到底哪个才是小胶质细胞?我看的文献有的是相反的。 ...

顶楼帖中其实写了,这两种并不矛盾,一般情况下是low或med,但在炎症状态下,CD45可上调。