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流式检测坏死性凋亡(Necroptosis)

发布者: niwanmao | 发布时间: 2022-4-25 09:41| 查看数: 184| 评论数: 0|帖子模式

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坏死性凋亡(Necroptosis)是脊椎动物细胞中发生的程序性细胞死亡过程,是因为感染的病原体抑制了经典凋亡过程。病原体通过其抗capsase活性阻断细胞凋亡,向坏死小体发出信号,通过坏死性凋亡导致细胞快速死亡,从而最小化病原体的传播。其他形式的坏死性细胞死亡,例如由非生理事件引起的胀亡(oncosis),通常导致细胞肿胀而死亡,细胞凋亡则相反,是引起细胞收缩的,而坏死性凋亡则是使得细胞内容物通过质膜受控渗漏。
首先,TNFα通过TNF受体的外在刺激信号传导TNF受体相关死亡结构域(TRADD)的募集,并反过来募集RIPK1。在没有活性半胱天冬酶8的情况下,RIPK1和RIPK3彼此自磷酸化和转磷酸化,导致形成称为坏死小体的微丝状复合物。然后,通过磷酸化激活促坏死蛋白MLKL。MLKL通过插入细胞器和质膜的胆脂膜激活坏死表型,导致细胞内容物排出到细胞外空间,见下图。
necroptosis.gif

细胞的炎症破裂将损伤相关分子模式(DAMPs)释放到细胞外空间。这些DAMP中有许多仍未确定,但是,已知“找到我”和“吃我”DAMP信号将免疫细胞募集到受损/感染的组织中。坏死细胞通过胞饮作用被免疫系统中清除,该过程由巨噬细胞介导。而免疫系统去除凋亡细胞则是通过吞噬作用(phagocytosis)。

许多药物如紫草素(Shikonin)也可诱导坏死性凋亡,见图。
necroptosisannexinv.gif


已知Necrostatin预处理后再与紫草素孵育,可抑制紫草素引起的坏死性凋亡,见图。
necrostatin.gif


流式细胞术检测坏死性凋亡
通过使用可固定的死活染料(Zombie NIR)、anti-active-caspasse-3、RIP3、H2AX、PARP等标记,可以通过流式细胞术区分坏死性凋亡、凋亡、坏死以及更细分的调节性细胞死亡方式。
2022-04-25_09-29-09.jpg
上图是RCD(调节性细胞死亡)分群示意图。a图通过Zombie和casepase-3散点图,分出Live cells(包括早期凋亡)和Dead(包括晚期凋亡)细胞。 b图和c图进一步分出坏死性凋亡(caspase-3−/RIP3高+)、早期或晚期凋亡(Caspase-3+/RIP3−)、RIP1依赖性凋亡(RIP1-APO,Caspase-3+/RIP3+)和双阴性(DN,Caspase-3−/RIP3的−)。然后将这些活细胞群和死细胞群中的每一个亚群继续在H2AX/PARP散点图上进行分析,分出DDR(H2AX+/PARP−)、PARP(H2AX+/PARP+)、parthanatos(H2AX−/PARP+)和QN(H2AX−/PARP−)。


参考文献:D Bergamaschi, A Vossenkaemper, WYJ Lee, P Wang, E Bochukova, G Warnes. Simultaneous polchromatic flow cytometric detection of multiple forms of regulated cell death. Apoptosis, 2019. (DOI: 10.1007/s10495-019-01528-w)

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