求助，对角线细胞是什么

不爱学习的木木

求助各位老师：样本：骨髓细胞，5个通道：FITC，BV510，APC，percp-cy5.5，PE-cy7，用淋巴细胞的CD4marker调好补偿后，上空白管发现多荧光通道出现对角线细胞，如图1所示：

图1

以为是死细胞，于是单染活死细胞染料FVS780，发现圈门后单染FVS780的其他荧光通道仍存在明显对角线细胞，如图2所示

图2

，请问这个是为什么呢：细胞非特异性荧光？机器质控？应该如何判断？

bslhk

对角线的细胞多数是死细胞，你反圈一下看看位置

niwanmao

三种可能性：
1、死细胞（但这从这些细条状分布看，不像）。
2、非特异性染色。
3、仪器液路脏或电子噪音引起的非特异性信号。

不爱学习的木木

bslhk 发表于 2022-8-15 08:48
对角线的细胞多数是死细胞，你反圈一下看看位置

好的，谢谢老师，我下午在机器上试一下，话说flowjo能操作嘛

不爱学习的木木

bslhk 发表于 2022-8-15 08:48
对角线的细胞多数是死细胞，你反圈一下看看位置

圈出来根据7AAD染色，看着不像死细胞

不爱学习的木木

niwanmao 发表于 2022-8-15 09:06
三种可能性：
1、死细胞（但这从这些细条状分布看，不像）。
2、非特异性染色。

倪老师好，非常感谢您的解答，今天做了全血的和骨髓样本的活死细胞单染以及空白管，如图所示，好像都会存在这样一条对角线细胞，您觉得这会是什么原因呢，会不会跟细胞状态不好有关

niwanmao

不爱学习的木木 发表于 2022-8-15 20:22
倪老师好，非常感谢您的解答，今天做了全血的和骨髓样本的活死细胞单染以及空白管，如图所示，好像都会存 ...

CST正常，不代表液路干净，不代表没有非特异性信号。

所以，你需要先跑一管蒸馏水确认液路和电子噪音水平。

实际上，我觉得你目前的这个背景水平只要在1％以内，并且你要做的是含量较高的细胞，是可以接受的，完全都没有，是需要液路和流动室非常干净。

不爱学习的木木

niwanmao 发表于 2022-8-15 21:44
CST正常，不代表液路干净，不代表没有非特异性信号。

所以，你需要先跑一管蒸馏水确认液路和电子噪音水 ...

好的好的，谢谢您的建议，之所以纠结这一群是因为在圈FMO的时候因为他们的存在不知道该切在哪里比较合适，如图1,2所示。以及最后在算lin-CD34+细胞时，感觉这一群细胞会干扰结果。老师您可以帮忙再看下这样圈的有问题嘛

bslhk

不爱学习的木木 发表于 2022-8-15 20:11
圈出来根据7AAD染色，看着不像死细胞

把机器彻底清洗一下看看

niwanmao

不爱学习的木木 发表于 2022-8-15 22:09
好的好的，谢谢您的建议，之所以纠结这一群是因为在圈FMO的时候因为他们的存在不知道该切在哪里比较合适 ...

像其它站友所说，先多做几次大清洗看看。
如果实在无法解决，请采用对角线明显的散点图，做不规则的门分析结果，不要用直方图或矩形门。见下图：