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排除粘连体,究竟散射光信号好还是荧光好?

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发表于 2022-9-19 20:31:23 | 显示全部楼层 |阅读模式

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粘连体的排除,通常基于散射光参数的脉冲信号:面积,A;高度,H;或宽度,W
俩俩组合可用于区分信号究竟是单细胞还是粘连体。最常用组合是FSC-A 与 FSC-H,也可用 FSC-H 与 FSC-W、SSC-H 与 SSC-A 以及 SSC-H 与 SSC-W。

但是,荧光信号的A、H或W也可用于区分粘连体,这在细胞周期分析中经常使用,对于识别真正的 G2/M 期细胞和 G0/G1 期至关重要。然而,在研究活化或增殖细胞时,用FSC和SSC的脉冲信号区分单细胞和粘连体可能就很困难了。西班牙的Laura G. Rico等人比较了使用散射光和荧光排除粘连体的能力,发现:对于高度浓缩的细胞产物和病理标本,无论是 FSC 和 SSC 高度、面积和宽度均能很好排除粘连体(下图的A氯化铵裂解液、B含多聚甲醛醛的商品化红细胞裂解液),同样,利用活细胞DNA 染料(例如 Vybrant DyeCycle Violet(DCV)染料或 Hoechst 33342)也能很好的排除粘连体(下图D和E),但是,如果是不裂红不洗涤的话,FSC和SSC的脉冲信号就无法排除粘连体了,一团糟(下图C),而活细胞DNA染料的脉冲仍然不仅能够排除掉红细胞,而且仍然能很完美的排除粘连体。
截屏2022-09-19 20.24.33.png


所以,如果你的标本希望不裂解不洗涤的话,可试一下用活细胞核酸染料的A、H排除一下粘连体看看吧。

信源:Rico LG, Bardina J, Bistué-Rovira À, et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques [published online ahead of print, 2022 Sep 16]. Cytometry A. 2022;10.1002/cyto.a.24690. doi:10.1002/cyto.a.24690

Cytometry Pt A - 2022 - Rico - Accurate identification of cell doublet profiles .pdf

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发表于 2022-9-20 08:29:41 | 显示全部楼层
长知识。以前没用过。
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发表于 2023-1-28 13:42:31 | 显示全部楼层
进行的T细胞增殖检测,单细胞这么画门适合吗
111.jpg
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 楼主| 发表于 2023-1-28 20:16:31 | 显示全部楼层
飞翔 发表于 2023-1-28 13:42
进行的T细胞增殖检测,单细胞这么画门适合吗

单细胞门,感觉是由于仪器原因导致未在斜向直线上,这样容易把大细胞去掉了,还是不要设单细胞门了吧。
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发表于 2023-1-29 07:55:43 | 显示全部楼层
本帖最后由 飞翔 于 2023-1-29 07:57 编辑
niwanmao 发表于 2023-1-28 20:16
单细胞门,感觉是由于仪器原因导致未在斜向直线上,这样容易把大细胞去掉了,还是不要设单细胞门了吧。 ...

BD的仪器,这个斜向直线需要单独设置吗?T细胞增殖实验的话,右上部分的大细胞是增殖的T细胞?
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 楼主| 发表于 2023-1-29 14:06:54 | 显示全部楼层
飞翔 发表于 2023-1-29 07:55
BD的仪器,这个斜向直线需要单独设置吗?T细胞增殖实验的话,右上部分的大细胞是增殖的T细胞? ...

右侧偏离的那些大细胞,可能不是T细胞,从singlet门的意义来说,只是纯粹排除粘连细胞,而不是圈淋巴细胞,所以如果把这些细胞排除在外,就失去了这个门的意义。
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发表于 2023-1-29 15:38:34 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2023-1-29 14:06
右侧偏离的那些大细胞,可能不是T细胞,从singlet门的意义来说,只是纯粹排除粘连细胞,而不是圈淋巴细胞 ...

明白了,谢谢,倪老师
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发表于 2023-1-29 15:39:42 | 显示全部楼层
飞翔 发表于 2023-1-29 15:38
明白了,谢谢,倪老师

不过那群大的细胞可能是单核细胞吗?也是CD4阳性的细胞
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 楼主| 发表于 2023-1-29 16:38:18 | 显示全部楼层
飞翔 发表于 2023-1-29 15:39
不过那群大的细胞可能是单核细胞吗?也是CD4阳性的细胞

有可能,通过CD4的强度可区分。但最好是有CD3等特异性标记去排除。
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