CFSE染色后立即上机出现双峰的问题

XYT

请问一下各位老师，我做的人外周血淋巴细胞CFSE染色，用0.1%BSA-PBS重悬细胞，调整细胞浓度为2×10^6/ml，加入0.5ulCFSE（终浓度为2.5uM）,37℃温育10分钟，每2分钟晃动一次细胞，加入预冷的5倍体积完全培养液5min，再洗涤1次，用1ml室温完全培养液重悬细胞后马上上机，得到的结果显示CFSE为双峰，不知道是什么原因等导致，CFSE没染上？

niwanmao

终浓度2.5是不是太低了？导致染色不均匀？
试一下5看看

XYT

niwanmao 发表于 2022-9-22 19:36
终浓度2.5是不是太低了？导致染色不均匀？
试一下5看看

老师好，上次做实验用的5uM（不过染的细胞数是4×10^6左右），也是分了两群。那我应该试一试1×10^6/ml用5uM浓度？【担心CFSE细胞毒性所以设置浓度相对低】

niwanmao

XYT 发表于 2022-9-22 19:43
老师好，上次做实验用的5uM（不过染的细胞数是4×10^6左右），也是分了两群。那我应该试一试1×10^6/ml用 ...

可以做一个浓度梯度。

另外，建议看一下FSC和SSC散点图，是否圈进了细胞碎片或噪音信号？

XYT

niwanmao 发表于 2022-9-22 19:51
可以做一个浓度梯度。

另外，建议看一下FSC和SSC散点图，是否圈进了细胞碎片或噪音信号？ ...

好的，已上传到帖子里，应该还好？

niwanmao

XYT 发表于 2022-9-22 23:15
好的，已上传到帖子里，应该还好？

先做浓度梯度看看吧。

XYT

niwanmao 发表于 2022-9-23 09:12
先做浓度梯度看看吧。

嗯嗯，好的，谢谢老师~

XYT

niwanmao 发表于 2022-9-23 09:12
先做浓度梯度看看吧。

老师您好，我上传了CFSE浓度梯度1.25uM、2.5uM、5uM、10uM，我发现第一个圈门圈靠右一点结果相对好些，不知道这样靠谱不，后3个浓度梯度貌似差异不大。

niwanmao

XYT 发表于 2022-9-25 13:49
老师您好，我上传了CFSE浓度梯度1.25uM、2.5uM、5uM、10uM，我发现第一个圈门圈靠右一点结果相对好些，不 ...

5开始就没问题了，可以用5uM

只是是不是红细胞裂解的问题，FSC/SSC没分开，这样比较容易影响设门，可增加一个特异性标记去掉红细胞和碎片。