小鼠肿瘤浸润淋巴细胞

如果有人呼唤

各位老师好！我最近在做小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的检测，在表面染色完成后上机检测CD3 CD4 CD8分群还算正常，但是破膜后打算染核内Foxp3，再上机就发现活细胞比例明显降低，并且连CD45阳性群几乎很少了。
1、请问老师是不是破膜后离心丢失了一部分细胞导致了这种情况？或者破膜剂是否会影响CD45？

2、我想染胞内细胞因子，需要用PMA/离子霉素刺激，那么肿瘤组织制备的单细胞悬液中大部分都是肿瘤细胞，会不会影响刺激效果？是否需要先用梯度密度离心法提取一下淋巴细胞再刺激？
谢谢老师们！

H4nn1

之前做过一些小鼠PD的实验，
死活染色应该是最早一步就完成了，所以正常情况下这个比例不会差很大。
固定破膜染色后，可以使用较大的离心速度和时间 像600g，8min，去确保收集大部分的细胞。之前的经验没有发现对CD45检测有影响。
第二个没有做过，但是感觉ficoll可以尝试一下 但是细胞应该会很少

niwanmao

1、是否没有经过固定？直接破膜？这样会使细胞碎裂。
2、最好Ficoll提取一下，还需要确认提取后的淋巴细胞比例，太少话可能效果不好。

Climber

CD45阳性群减少 从你的描述看 有一种可能是在用Fxop3的打孔试剂盒后细胞的FSC和SSC信号都会减弱，如果采用与未打孔细胞相同的FSC SSC电压和圈门方式 很可能会丢失细胞群

如果有人呼唤

niwanmao 发表于 2022-9-29 19:42
1、是否没有经过固定？直接破膜？这样会使细胞碎裂。
2、最好Ficoll提取一下，还需要确认提取后的淋巴细胞 ...

谢谢老师的解答！
1. 我用的是BD公司的Transcription Factor Buffer Set，里面是Fix/Perm Buffer，固定和破膜是同步的。我以前做过人外周血PBMC的时候也用了这个产品，当时觉得破膜之后离心会损失不少细胞，需要加大离心速度和时间。我现在初步怀疑可能还是丢失了部分细胞，而肿瘤细胞太多了让我忽略了这个问题。
2. 老师，梯度密度离心法是利用细胞之间比重的不同进行分层，请问老师肿瘤细胞的比重一定比淋巴细胞大吗？还是说不同的细胞系也不一样呀？

如果有人呼唤

H4nn1 发表于 2022-9-29 15:03
之前做过一些小鼠PD的实验，
死活染色应该是最早一步就完成了，所以正常情况下这个比例不会差很大。
固定破 ...

谢谢您的解答哦！我也觉得破膜对死活和CD45应该影响不大。我确实离心速度太低了，只有350g, 6min，我再试试加大离心速度和时间，谢谢啦！

如果有人呼唤

Climber 发表于 2022-10-3 10:57
CD45阳性群减少 从你的描述看 有一种可能是在用Fxop3的打孔试剂盒后细胞的FSC和SSC信号都会减弱，如果采用 ...

谢谢！您说的这个问题我也注意到了，但我即使在all events下圈活细胞，也有上述问题。我猜测可能还是丢失了部分细胞的原因，最近几天再试一下看看结果。

niwanmao

如果有人呼唤 发表于 2022-10-4 20:50
谢谢老师的解答！
1. 我用的是BD公司的Transcription Factor Buffer Set，里面是Fix/Perm Buffer，固定和 ...

1、操作步骤上，你还是得再认真回忆一下，因为我们看不到你的操作，也无法帮你明确究竟是哪一步出了问题。
2、Ficoll离心确认提取淋巴细胞分析，应该是你的实验重点，所以肿瘤细胞的比重是否比淋巴细胞大，不应该属于考虑范畴，因为肿瘤细胞不是你的目标。

忞勣的FACS

1、固定破膜后，细胞变小，所以离心力应该加大，600g，5min
2、活细胞比例明显降低，是用什么染料判断细胞死活的呢？那死细胞比例也是同步明显降低的吗？如果是的话，应该是离心步骤出错了
3、CD45是先表染，后再固定破膜的，所以对CD45影响有限，反过来就影响大了

如果有人呼唤

niwanmao 发表于 2022-10-5 16:02
1、操作步骤上，你还是得再认真回忆一下，因为我们看不到你的操作，也无法帮你明确究竟是哪一步出了问题 ...

老师，我又重复了实验，现在感觉不是细胞丢失的问题，就好像是破膜之后荧光都没有了，细胞都不分群了，我还是严格按照说明书做的。我用了bd和赛默飞的破膜剂，都没有改善。以前做人外周血PBMC没有出现这种情况，不知道是不是种属的问题。老师，请问您的破膜剂有试用装可以用一下嘛？谢谢老师