流式在CAR T细胞药代动力学监测方面的思考

niwanmao

最近Jiali Cheng等人在Cytometry A上发表的一篇论文（Cheng J, Mao X, Chen C, Long X, Chen L, Zhou J, Zhu L. Monitoring CAR19 T Cell Population by Flow  Cytometry and its Consistency with ddPCR. Cytometry A 2022.  ）比较了流式细胞仪和PCR在检测罕见嵌合抗原受体（CAR）T细胞方面的表现。


CAR T细胞在回输时有一个最初的扩增阶段，使用低亲和力的CD19 CAR受体可以改善这一情况。由于CAR T细胞的耗尽，再加上天然T细胞群的逐渐重建，CAR T细胞的比例会呈指数级下降。回输几周后，循环中的CAR T细胞数量变得很低，但可以持续几个月，确保长期保护患者，避免肿瘤复发。检测外周血中残留的CAR T细胞，面临的是与MRD相同的问题：该选择哪种技术进行检测，是非常精确和快速的流式还是高灵敏度的PCR？ Jiali Cheng等人认为PCR方法可以检测到低至每µg DNA的5个拷贝，而流式的检测限低于0.05%的淋巴细胞。

下图是流式细胞术监测外周血中 CAR-T 细胞命运的示意图。简而言之，多克隆淋巴细胞在体外被转入一种人工识别受体，被刺激扩增和成熟，并重新回输到患者体内，迁移至组织以杀死肿瘤，或迁移至淋巴结以进行长期记忆和治疗可持续性。 CAR-T 动力学有几个步骤： 1-在基因修饰之前存在正常淋巴细胞（B 细胞耗尽的情况除外）。 2- 准备好回输的CAR-T 大部分是 CD4+ T，CD8+T 细胞较少，大部分表达 CAR 受体。 3-重新输注后不久，CAR-T 在外周血中占多数，具有不同的效应/归巢能力以及免疫调节共同受体。 4-部分被驱动到淋巴结，而 5-其他部分被驱动到组织和肿瘤。 6- 几周后，正常的淋巴细胞群重新组成，而 CAR-T 耗尽、下降并成为罕见的检测事件。流式细胞术可以在治疗的任何阶段监测 CAR-T 数量以及归巢和细胞毒性等功能。


在看完这篇文献之后，我们需要做一些思考：

第一个问题是：我们真的需要在回输后检测外周血中的CAR T细胞吗？ 由于CAR T细胞治疗的最终目的是消除肿瘤细胞，所以，有必要检测。

第二个问题是：我们能否通过流式有效地检测CAR T细胞？这个问题已经得到了解决，目前已有一些方法可以通过流式细胞仪有效地检出CAR T细胞。这些工具包括一个通用的免疫球蛋白结合蛋白，如Protein L（可以识别kappa和lambda轻链）或者一个重组的TAA靶抗原（可被CAR T细胞受体识别和稳定地结合），最后，可用抗独特型抗体识别结合位点。Jiali Cheng等人认为用流式细胞术检测CAR T细胞，尤其是用抗独特型抗体检测CAR T细胞，其LOD值为0.03678%（健康全血平均+3SD)，合理变异系数在11%以下。


第三个问题是：流式细胞术在检测稀有CAR T细胞方面是否会与液滴数字PCR（dd-RT PCR）有相似的灵敏度？两种方法在临床样本上有非常相似的灵敏度和合理的相关系数(r=0.68)。这表明流式细胞术是适合早期监测CAR-T和晚期监测稀有残留细胞。

但这项工作也存在一些问题：
- 通过 dd-RT PCR 测量的 DNA 拷贝数，和通过流式细胞术测量的外周血 CD45 bright白细胞中计数，两者之间是否相同？一个 CAR DNA 拷贝是否代表一个转染的 T 细胞？
- 作者指出，除非白细胞计数非常低，否则对全血进行 CAR T 细胞检测；在白细胞少的时候，样品在染色前需进行裂解和洗涤浓缩，这种预处理过程是否会影响？
- 不少研究中使用CAR T细胞(分子)占总淋巴细胞(分母)的相对比率，但已有研究表明，CAR T遵循先扩增后减少的动力学规律，而正常T细胞的情况通常相反，这样的话，如果作者采用绝对细胞计数，可能会更有价值。


最后，流式细胞术检测有助于了解免疫细胞的功效和功能参数，虽然CAR-T回输的细胞主要是CD4+和CD8+T细胞，但可能也有其他细胞毒细胞，如NK或其他ILC，这些细胞可能也经过基因改造，并在扩增阶段幸存下来，所以有必要全面了解免疫细胞组成。另外，通过了解免疫细胞亚群的异质性、效应状态和归巢能力，从而了解CAR-T的抗肿瘤效果。


信源：Lambert C, Ntrivalas E, Sack U; flow cytometry working group of the international Federation of Clinical Chemistry (IFCC). A new story for an old challenge: would flow cytometry beat molecular biology in monitoring CAR T cell pharmacokinetics? [published online ahead of print, 2022 Oct 5]. Cytometry A. 2022;10.1002/cyto.a.24695. doi:10.1002/cyto.a.24695

Yuck

测LOD值如何进行实验设计呢，老师能大概说一下吗0.03678%是咋来的

Yuck

文章求到了，看到了实验设计。