艾森流式细胞仪阈值改变导致CBA标曲拟合不出来

wxx1220

使用艾森流式细胞仪，电压不变，用阈值10000，上样CBA 标品，得到数值导出FCS，用FCAP分析和flowjo分析出MFI，在拟合都能得到很好的曲线。但是用阈值100000，上同一标品得到数值导出FCS，用FCAP分析和flowjo分析出MFI，在拟合不出标曲，即MFI不随浓度增高而升高。
但两种情况在艾森流式细胞仪上显示正常，MFI随浓度升高而升高，用期显示的MFI去拟合可得到很好的标曲
这是为什么呢？

在流式细胞仪beads 位置相同。

niwanmao

信号都没问题。
问题应该出在你上样的时候，不同浓度上反了。

阈值10000的，趋势不错，但最后625和1250这两管，肯定反掉了，因为625的反而荧光强度大于1250。只是因为其它点都是好的，所以不影响你最后的拟合。

而阈值100000，至少两个地方反了，第一个是10和20，第二个也是625和1250。多个点错乱，曲线肯定拟合不好。

haoxu

阈值设置100000拟合不起来的原因是因为你导出的数据与FCAP软件的兼容性差导致的。
你将安捷伦的数据导出时高级设置-参数设置由“自动”修改为“根据图”，然后导出FCS格式的数据就可以拟合了。
导出前确保所有样品荧光通道的坐标轴一致，并且最高浓度和最低浓度都在坐标轴范围内。

wmj123456

niwanmao 发表于 2022-10-27 20:49
信号都没问题。
问题应该出在你上样的时候，不同浓度上反了。

倪老师，能否请教个细胞因子的问题，一共是5个指标，A-D是一个试剂盒，E是单独试剂盒，第一次做的C0孔浓度还可以接受，A指标是15pg/ml左右，B-D都是在3pg/ml左右，E是0pg/ml。但是第二次做的C0孔，A是31，B是7，C是12，D是11，E是0.33，请问，
1为什么2次C0孔差异这么大？第一次是做了完整的标准曲线，第2次是只做了C0孔，用的是第一次的标曲曲线
2在确定PE电压的时候，用标曲最高浓度确定的，微球在PE的靠右侧了，如果降低PE的电压，是否第2次C0孔浓度就降低了？但是2次都是一样的电压条件，为何第一次的C0孔浓度没有那么高？
3如果想排除试剂或者操作的问题，想同时也去其他仪器上跑下这个实验，不同仪器上怎么具有可比性？因为PE电压不同，那么肯定C0孔电压又不同了。

niwanmao

wmj123456 发表于 2024-6-22 11:54
倪老师，能否请教个细胞因子的问题，一共是5个指标，A-D是一个试剂盒，E是单独试剂盒，第一次做的C0孔浓 ...

这里的描述我一下子难以读懂，但是同一样本不同试剂盒或者同一试剂盒不同时间产生差异，需从多方面找原因：
1、仪器稳定性，包括液路和电压，在某些仪器上会出现不同日期之间的漂移，需注意做好每日的质控和校准
2、样本是否存在降解？尤其是保存条件很重要
3、操作上，不要小看加样精度引起的差异

wmj123456

niwanmao 发表于 2024-6-22 15:18
这里的描述我一下子难以读懂，但是同一样本不同试剂盒或者同一试剂盒不同时间产生差异，需从多方面找原因 ...

倪老师，这里不牵涉样本，2次做的是标准品的C0孔，用的是同一个试剂盒，都是一样的试剂，一样的操作。区别在于第2次的PE荧光强度增加了，所以浓度也增加了。

如果排除掉实验操作的问题，可能是仪器每天的状态不稳定导致的把

niwanmao

wmj123456 发表于 2024-6-22 18:14
倪老师，这里不牵涉样本，2次做的是标准品的C0孔，用的是同一个试剂盒，都是一样的试剂，一样的操作。区别 ...

如能确保加样精度上没问题，暂时考虑仪器的液路可能

tzyycat

wmj123456 发表于 2024-6-22 18:14
倪老师，这里不牵涉样本，2次做的是标准品的C0孔，用的是同一个试剂盒，都是一样的试剂，一样的操作。区别 ...

你可以拉个双参图看看，横坐标改成time，看看液路是不是连续的，如果中间有断开可能是有气泡，有时候液路里面有气泡也会导致两次结果有差异的