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[淋巴细胞相关] 同型对照界定阴性群,阳性率太高!还是抗体本身有问题?

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 楼主| 发表于 6 天前 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
本帖最后由 wli123 于 2022-11-22 20:48 编辑

     倪老师好,各位老师们好,现在我想向大家请教一个困扰了我很久的问题:我要检测人外周血CD4阳性淋巴细胞中的亚群,在确定电压和补偿没问题的情况下,无论用空白对照、同型对照还是FMO对照,还是换机器检测,有一个marker的阳性率就是非常高,CD4阳性门里,FL2(本文描述的问题marker)/FL3双阳群占FL3单阳群接近100%,占CD4阳性群的百分之六七,而文献中正常一般占CD4阳性群的1%以下。
     因为不管是空白对照、同型对照还是FMO对照,这个marker的阴性线都是在10左右,如果阳性标本的阴性线划在10左右,这个指标就非常高。如果将10界定为阴性线,阳性标本中的阳性群又能看出两群细胞(在有些文献中,这个marker是有高低表达之分的),如果将10到100之间的这群细胞界定为阴性细胞,这个marker的比例就接近文献中的数据了。可是将此marker的阴性线划在100,该如何解释呢?我找不到依据。还请各位老师指点迷津,万分感谢!
(1)


微信图片_20221122180840.jpg
图1说明:H12.006是同型对照(空白对照跟这类似),H12.007是阳性全染样本。根据同型对照,将阴性线划在10,FL2/FL3双阳的细胞占达到了5.91%(占CD4门),这个数据与文献严重不符,因为文献中一般在1%以内,最多不超过2%。而且所有的样本都如此。

(2)仔细观察,感觉FL2的单阳管和全染管中,如果将10界定为阴性线,在阳性群里是能看出又分了两群细胞的。
3.jpg
(3)

如果将FL2的阴性线提高到100,这个数据跟文献就相符了。但是我找不到可以解释的依据。
2.jpg
(4)我想用倪老师讲的生物学阴性对照试一下。(FL2这个marker只表达在活化的T细胞和少量胸腺细胞中,粒细胞不表达,所以在全染管中圈了粒细胞门看FL2的表达。)发现有些样本貌似可以解释(图4),有些样本就不太合适(图5)

202211226-Layout.jpg
图4:第2个图是粒细胞圈门,感觉把阴性线划在100,第3个图(全染管)淋巴门中的阳性表达率就是正确的。但是有人告诉我说同一marker在不同细胞群的阴性线位置可能不同,不能这样圈门。这样说有道理吗?



20221122-Layout.jpg

图5:这个样本的FL2marke如果将阴性线划在10,阳性率依然非常高。按照粒细胞这样圈门,划到100多一点儿,数据就正确了。但是这个图里,粒细胞的阴性线是不是划得太远了?实际上说它在10多一点点儿的位置也没关系?

  我这个实验做了快一年啦,反反复复折腾,不停地调条件、改变细胞提取方法、换机器,最后都没能解决阳性率高的问题。有可能是抗体本身的原因吗(抗体是Biolegend公司的)?恳请老师们帮我分析原因,予以解答!万分感谢,在线急等!


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 楼主| 发表于 6 天前 | 显示全部楼层
不好意思,第一次发帖子,感觉排版有点儿乱,请大家谅解。
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 5 天前 | 显示全部楼层
这些图与文字之间对应了半天,大概了解了点。
针对FL2通道这个目标抗体的FMO对照做过没有?
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 楼主| 发表于 5 天前 | 显示全部楼层
本帖最后由 wli123 于 2022-11-23 19:34 编辑
niwanmao 发表于 2022-11-23 12:26
这些图与文字之间对应了半天,大概了解了点。
针对FL2通道这个目标抗体的FMO对照做过没有? ...

谢谢倪老师的解答,真是不好意思,因为机器是Calibur,不太方便在坐标轴上标注抗体名称,抱歉让大家看起来比较费劲。

做过FMO,结果是一样的,FL2的阴性位置更低,在10以内了。所以按照FMO划阴性线,结果依然很高。

20221123-Layout.jpg
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 楼主| 发表于 5 天前 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-11-23 12:26
这些图与文字之间对应了半天,大概了解了点。
针对FL2通道这个目标抗体的FMO对照做过没有? ...

倪老师,补充说明一下,我这个抗体是PE标记的抗人ICOS。

昨天晚上我自己又去其他品牌的官网查看了FL2(PE-ICOS)的抗体信息。发现这家抗体说明书中特意指出来自C398.4A的克隆号不合适,因为它既结合人外周血活化的T细胞还结合很多非活化的T细胞,而我想检测的是活化的T细胞部分。所以用C398.4A克隆号就会导致FL2(PE-ICOS)阳性率过高。
  我目前用的这个抗体就是C398.4A克隆号的,所以可能跟抗体不合适有关系,对吧?
关于FL2抗体的说明书截图.jpg
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发表于 5 天前 | 显示全部楼层
wli123 发表于 2022-11-23 19:45
倪老师,补充说明一下,我这个抗体是PE标记的抗人ICOS。

昨天晚上我自己又去其他品牌的官网查看了FL2(PE ...

如此看来还是抗体的非特异性结合引起的。所以同型对照跟抗体不匹配,你就不能用同型对照设门。

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 楼主| 发表于 5 天前 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-11-23 21:37
如此看来还是抗体的非特异性结合引起的。所以同型对照跟抗体不匹配,你就不能用同型对照设门。

...

谢谢倪老师,那我该用什么设门?难道我觉得将阴性线划在100,得到的数据与文献相符,我就将阴性线划在100?
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