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如何评价Fc阻断的效果?设门要选择什么对照?

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 楼主| 发表于 4 天前 | 显示全部楼层 |阅读模式

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流式细胞术利用荧光标记的抗体区分不同细胞亚群。抗体结合的特异性取决于每个抗体克隆的独特可变区,但是,抗体共同具备的Fc片段,却与体内效应功能相关的绝大多数免疫细胞(如B淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、人血小板、肥大细胞和嗜碱性粒细胞)均能相互作用,这些细胞在其表面表达多种Fc受体,因此导致在流式分析中容易出现背景增高或甚至假阳性信号。其中以单核细胞和巨噬细胞尤为显著。

解决方法通常有两种:

1、常见方法是在用荧光素标记的抗体染色之前,先通过使Fc受体饱和达到阻断的效果。比较有效的Fc阻断剂包括:

(1)商品化的Fc Block(25ug/ml或10ug/ml);

(2)2.5%或10%的人血清或小鼠血清;

(3)100ug/ml的人IgG。

注意,染色缓冲液配方中通常包含的胎牛血清IgG含量太低,达不到足够的阻断Fc受体效果。

2、使用重组抗体(例如Fab片段基因重组抗体)

同型对照(具有不相关特异性的标记抗体)可用于评估Fc阻断方案的有效性。如下图,虚线是未经Fc阻断的同型对照染色,实线是经过Fc阻断之后的同型对照,可见Fc阻断之后,同型对照的荧光明显降低,说明Fc阻断对你的实验是有效果的,在正式实验方案中,就可以用Fc阻断减少这些Fc受体非特异性结合引起的背景。
FcBlock.PNG

然而,不建议将同型对照用于设门,设门参照有如下选择:
- 最佳的是生物学阴性对照,就是用同一生物来源的不表达目标抗原的细胞,最好是细胞大小和颗粒度比较接近的(例如CD56可以用B细胞做生物学阴性对照)
- 如果生物学阴性对照无法找到,则可用RNAi或CRISPR技术制备抗原敲除的同种细胞;倘若感觉成本过高并且多色实验中荧光渗漏是主要的背景,则退而求其次用FMO对照。


参考源:
https://www.uth.edu/imm/service-centers/flow-cytometry/fc-block
https://www.bio-rad-antibodies.c ... gical-controls.html
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发表于 3 天前 | 显示全部楼层
同型对照在表面染色时应不应该加呢,有时还有争议,这个就是最好带上吧
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发表于 3 天前 | 显示全部楼层
巨噬的背景和假阳真的很高,我们现在还是得从ssc里先区分出淋巴和多核细胞,再去区各个亚群,或者先把巨噬单核粒从CD45+圈出去再画淋巴也会好看一些,加大Fc的量会不会有用?
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 楼主| 发表于 3 天前 | 显示全部楼层
飞翔 发表于 2022-11-25 07:44
同型对照在表面染色时应不应该加呢,有时还有争议,这个就是最好带上吧

生物学阴性对照,可替代同型对照。这是肯定的。

放同型对照的文献,主要两种可能性:
1、不懂。
2、实在找不到生物学阴性对照,又没办法去制备RNAi或CRISPR技术制备抗原敲除的同种细胞。
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