小鼠的免疫衰老，应选择什么标记？如何分析？

niwanmao

为了研究小鼠模型的免疫衰老，我们需要考虑小鼠和人类的衰老过程的重叠和差异。这种差异可能反映了两个物种之间的内在差异（如寿命、体重、端粒长度或端粒酶活性，或者人类在现实世界中经历了一系列的环境暴露，而小鼠通常是在SPF设施的控制和无菌环境中进行研究。因此，**小鼠长期暴露于无处不在的环境微生物，如长期持续的病毒感染（如CMV感染），可能比它们在无菌环境中的维护更能反映自然老化过程。**

在对小鼠进行研究时，18个月以上的小鼠被认为是真正的衰老。与年轻人和老年人之间的差异类似，3个月大的年轻小鼠在血液和淋巴组织中具有较高的初始T细胞比例，但随着胸腺的退化，初始T细胞的相对比例和绝对计数随着年龄的增长而大幅下降。相反，记忆性T细胞亚群的比例和数量随着年龄的增长而增加，因为接触抗原的历史在衰老的宿主身上留下了痕迹。


通过流式细胞仪对初始型和记忆型T细胞亚群进行表型区分，依赖于T细胞分化过程中获得或丧失的标记物的组合，从初始型和记忆型到终末分化的T细胞。一些用于识别人类初始和记忆T细胞亚群的标记物，如CD45RA不适合用于鼠类T细胞亚群的表型。在小鼠中使用CD44、CD62L和CCR7等标记物来识别初始（Tn）、中央记忆（Tcm）和效应记忆（Tem）/效应（Teff）亚群，以及KLRG1和CD127，用于识别记忆前体效应细胞（MPEC）和短寿命效应细胞（SLEC）亚群。见下图，SPF 3个月大和18个月大的C57BL/6J小鼠的脾细胞，分别分析Tn、TVM、Tcm和Tem CD8 T细胞亚群：


下表是4个亚群在年轻小鼠和年老小鼠中的比例：



除了这些经典的T细胞亚群外，我们还可以评估T细胞的衰老标志物。一些用于人类的表面标记，如CD57的表达、CD28的缺乏和CD45RA的重新表达，并不能用在小鼠上。端粒长度在人类中也通常被评估为细胞年龄和复制性衰老的指标，但这种方法在小鼠中是有限的，因为小鼠的端粒相对较长，这意味着端粒的缩短可能不是免疫衰老的主要驱动因素 。然而，小鼠中的衰老T细胞确实表现出NK细胞相关标志物的表达增加，如KLRG1，以及CD27的丢失，使我们能够有力地分离小鼠中的记忆亚群和更终期分化的群体。小鼠和人类的衰老T细胞都表现出细胞膜中**磷酸化的γH2Ax**的增高，是ATM激酶活性增加、DNA损伤增加和DNA损伤衰老表型的一个指标。


下图是8个月大的C57BL/6J小鼠的外周血，通过实验慢性持久性感染了10E6PFU的小鼠巨细胞病毒（MCMV）6个月，CD44hi CD11a hi群体中，根据CD27和KLRG1的表达可分出记忆T和TTDE：


实验小提示
在处理老年小鼠模型时，要考虑到小鼠将被安置在SPF条件下，这与人类完全不同，在人类的生命周期中，病原体暴露会不断积累。

老年小鼠可能积累与年龄有关的异常（如肿瘤），或者它们可能过度梳理自身皮毛导致皮肤擦伤和感染。这些因素均可能导致个别老年小鼠的免疫激活，因此需在分析中排除了有明显异常的小鼠。

随着年龄的增长，TVM细胞被选择性地保留，并经常被误认为是Tcm细胞。CD49d可区分Tcm和TVM细胞。

老年白细胞对物理操作更敏感，特别是红细胞裂解，所以要确保仔细掌握这一反应的时间。



编译自： Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition). Eur J Immunol. 2021;51(12):2708-3145. doi:10.1002/eji.202170126