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[淋巴细胞相关] 抗体染色百分之九十五阳性

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 楼主| 发表于 2023-1-12 22:06:57 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
倪老师,请问下,做的一个胞质表达的指标,单染,根据抗体说明书建议,用foxp3的固定破膜剂。抗体用量直接按照说明书建议的。但是结果发现抗体的阳性率几乎是百分之百。同时也做了一管阴性细胞的单染,即不表达这个抗原的细胞,也是出现了强阳性,请问可能是哪个方面的原因呢?
如果是抗体滴定没有做好,但是我了解的是,抗体用量不合适产生的非特异性染色,也会出现阴性细胞群的,但是目前用阴性和确定表达的阳性细胞,染色后的结果都是阳性,没有看到阴性。设门是用空白对照管来设门的,即只加细胞。

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发表于 2023-1-13 08:16:37 | 显示全部楼层
固定破膜剂,基本上都会造成本底荧光增强,所以必须要做好合适的对照。

如果是单染的,你可以用阴性细胞染色结果作为设门参照,如果阴性细胞和阳性细胞的表达水平几乎重叠,说明破膜效率或者抗体性能需要另外验证。
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 楼主| 发表于 2023-1-13 09:22:17 | 显示全部楼层
倪老师,您指的破膜效率是什么意思?会不会存在抗体破膜剂里的某些成分跟抗体发生菲特异性的结合?抗体性能是指的抗体质量,还是要做下抗体滴定?
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发表于 2023-1-13 10:12:14 | 显示全部楼层
wmj123456 发表于 2023-1-13 09:22
倪老师,您指的破膜效率是什么意思?会不会存在抗体破膜剂里的某些成分跟抗体发生菲特异性的结合?抗体性能 ...

破膜效率,指的是破膜成份打孔是否成功,假如目标结合位点在细胞核内,而该破膜剂对核膜破膜能力不够,可能就导致结合不上去。因为你前面说阴性和阳性样本结果差不多,所以我觉得可能两者都没结合上。

破膜效率,可以用表达较高的核内、胞内标记确认。

固定之后,本身就会产生明显的背景荧光,这个并不是某些成份与抗体发生的非特异性结合。

抗体性能,指的是该抗体是否能够很好的结合目标位点,可以在高影响因子的文献里面,找对应克隆号的抗体,并且尽量找亮度高的荧光素标记。
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