小鼠淋巴细胞培养后测凋亡

家飞的清

本人最近提小鼠脾淋巴细胞，阴性分选出CD 4T细胞，然后加入含ConA 20ug/mL的1640完全培养基培养2天，显微镜镜下细胞已经聚集成团，在培养2天加入一些不同浓度的药物培养24小时，然后取细胞悬液做ANNEXIN V、PI染色，组别做了空白组（没有加药物、没有双染，该组是定阴性群位置），其他的是样本组加双染，结果所有的样本组，早凋、晚凋之和约100%，活细胞极少，不知道这个流式画门、分群对了没有；之前曾提取细胞培养，不过当时直接就做了双染，但是细胞就只有一群，几乎没有早凋、晚凋。不知道为什么是这样，有人说细胞养不好，尤其是未加药物组细胞若没有养好，跑凋时，流式机上调不好电压，不知道为什么之前我的细胞要么在流式机上就看起来只有一群细胞，要不就早凋晚凋极多呢 20230222凋亡.pdf (1.12 MB, 下载次数: 18)

2023-2-27 23:29 上传

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niwanmao

无论是单染还是双染，2月23日的结果似乎都是凋亡或坏死了。

这说明脾淋巴细胞提取时，是不是就已经发生了意外？

fhp111

20ug/mL conA太高了
1ug/ml 甚至更低的浓度就已经能刺激的很好了

家飞的清

niwanmao 发表于 2023-2-28 08:51
无论是单染还是双染，2月23日的结果似乎都是凋亡或坏死了。

这说明脾淋巴细胞提取时，是不是就已经发生了 ...

你好，我铺板时，细胞还是很好的，镜下细胞活力很好的

家飞的清

fhp111 发表于 2023-2-28 16:54
20ug/mL conA太高了
1ug/ml 甚至更低的浓度就已经能刺激的很好了

请问你养过小鼠的脾细胞吗，你有什么实验步骤吗，可以发我吗。
我试过2.5ug/mL、5ug/mL,第一天看的时候没有聚集成团，细胞也在死亡

fhp111

家飞的清 发表于 2023-2-28 21:18
请问你养过小鼠的脾细胞吗，你有什么实验步骤吗，可以发我吗。
我试过2.5ug/mL、5ug/mL,第一天看的时候没 ...

CFSE检测小鼠脾细胞中T细胞增殖（特异性抗原未产生激活刺...
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5317-1-1.html
(出处: 流式中文网)
实验步骤我参考的是这里。CFSE可不标。
1、建议你降低ConA浓度至1ug/ml
2、24孔板 每孔1^10^6个细胞 1mlRPMI1640 培养3天检测。
3、你的细胞是阴选的CD4+T, 建议先做一个全脾细胞的看看。

家飞的清

fhp111 发表于 2023-3-1 09:42
CFSE检测小鼠脾细胞中T细胞增殖（特异性抗原未产生激活刺...
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5317-1 ...

20X-第3天

4X-第3天

你好，感谢你的建议，我前几天没有上网，我把ConA降低到10ug/mL,阴性分选出小鼠脾CD4，按5*10^5个/孔,200uL培养基（培养基为20%FBS+1640+50um巯基乙醇+10ng/ml IL-2）,养了第一天开始，细胞就出现了小团簇，逐渐增多,第三天是团簇非常大，不过还是看到一些死细胞，也有一些细胞变得没那么圆。在第2天时加了药物，在第3天时测凋亡。现附上2张养了3天的图，现在我有两个问题：1.体外养T细胞怎么样子才是在增殖，在增殖时会不会有死细胞，增殖时细胞会不会部分集中在周边；2.如果我这两张图是在增殖，那我这个凋亡为什么看起来细胞全死了，是我画门、电压问题还是哪里？3.为什么T细胞凋亡时分群不清楚，不像肿瘤细胞的凋亡图那样的。

fhp111

纯CD4T用conA刺激我没做过。
纯CD4T用Anti-CD3/CD28刺激不是更好吗？
1、有团簇是增殖的表现，但不一定增殖的好，因为有时死细胞过多。
2、第一张图FSC-SSC中一般分左右两群。右边那群才是要圈门的，可以去看我引用的那个帖子。你这里似乎只有左边那群死细胞
3，确切的看细胞有没有增殖，染CFSE简单方便。