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想实现批量检测细胞内因子?可参考这个新方法,-80℃平均12个月稳定

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发表于 2023-3-5 22:08:55 | 显示全部楼层 |阅读模式

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在平时,大家经常会遇到要检测细胞内因子,但细胞刺激完了,却轮不到上机,怎么办?
可参考Corbière V等人开发的一种评估百日咳疫苗诱导抗原特异性T细胞胞内因子的两步法。
百日咳是一种由百日咳杆菌(Bp)引起的细菌性呼吸道疾病,尽管有高覆盖率的疫苗,但仍然是最难控制的可预防疾病之一。全细胞百日咳(wP)疫苗在20世纪40年代首次使用,后来在大多数工业化国家被反应性较低的无细胞百日咳(aP)疫苗取代,aP疫苗含有高纯度的Bp抗原,并以氢氧化铝为佐剂。尽管aP疫苗对百日咳有临床效果,但在使用aP疫苗的国家仍偶有百日咳暴发事件,并且aP预免青少年中的百日咳病例增加。aP疫苗诱导的免疫反应质量不佳以及免疫力快速衰退被认为是导致百日咳复发的原因之一。
因此,详细评估新型百日咳疫苗的免疫反应表征和保护效力,很有必要。Corbière V的方法,是先用Bp抗原短期刺激新鲜全血,并将刺激后的细胞在-80℃冷冻保存,然后再批量进行细胞内细胞因子分析,用流式定量测定了Bp抗原特异性产IFN-γ-、IL-4/IL-5/IL-13-、IL-17A/IL-17F-和/或IL-22的CD4+ T细胞,以揭示Th1、Th2和Th17型反应,同时还分析了IFN-γ产生的CD8+ T细胞比例。

全血刺激
这一步大家可根据自己的设计进行刺激。下面这作者的刺激步骤,不一定相同。
血液样本在采集后最多3小时内进行处理, 新鲜抽取的全血样本用含40 µg/ml 庆大霉素的RPMI 1640 培养基1:1稀释。 将抗CD28和抗CD49d抗体(分别为克隆 L293 和 L25.3)添加到稀释的血液中,每个终浓度为 1 µg/mL,以刺激产生抗原特异性T细胞的细胞因子表达。 将两倍稀释的血液分配到 15 ml 圆底聚丙烯管中,每个管含有 800 µl 稀释血液(对应 400 µl 原始血量),并在不存在(阴性对照)或存在抗原的情况下孵育,即 5 µg/mL PT、5 µg/mL FHA、10 µg/mL BPL、10 µg/mL TT、10 µg/mL Bp超声粉碎产物或 1 µg/mL SEB。 最佳抗原浓度要么基于文献(BP 超声处理、TT),要么基于 PERISCOPE 联合会(PT、FHA、BPL)的初步实验。 为了评估批内变异性,有些刺激组以一式两份进行。 试管松散地盖上盖子,并在 37°C 和 5% CO2 条件下孵育24小时。 在孵育的最后 4 到 5 小时内,将 10 µg/ml Brefeldin-A (Sigma-Aldrich) 和 1/1000 莫能菌素添加到每个管中以抑制细胞蛋白质转运。随后将细胞以 500 x g 离心沉淀 10 分钟。

冻存之前的处理
用氯化铵裂解液裂解红细胞后,再用PBS以 500 x g 离心 10 分钟洗涤,弃去上清液,加入1 mL固定液孵育固定白细胞,室温下避光作用20 分钟。 以 500 x g 离心 5 分钟后,将白细胞冷冻保存在 500 µl 特殊的冷冻培养基 (ThermoFisher) 中,该培养基基于 Dulbecco 改良 Eagle 培养基(高葡萄糖),含优化水平的胎牛血清、牛血清和10% DMSO。
将细胞转移到冷冻管中,在 -80°C 下储存。就可以分批随时分析。 在直接染色和流式细胞术采集的情况下,白细胞通过与 2 mL Perm/Wash 溶液(来自 BD Cytofix/Cytoperm 固定/透化试剂盒,BD biosciences)在 RT 中孵育 10 分钟直接透化 黑暗的。


解冻和进一步处理
当时间合适时,就可以从-80°C 冰箱中取出冻存的样本,在 37°C 水浴中解冻 2 分钟。
将解冻的细胞从冷冻管中转移到含5mL PBS 的 15 mL 锥形管中。 在 500 x g 下离心 5 分钟后,加入2 mL破膜剂,并在室温下孵育 10 分钟。后续,就可以加入你要染色的表面抗体和细胞因子抗体,避光室温孵育30分钟即可洗涤后上机检测。
作者证明了这种基于全血的Bp特异性细胞内染色法具有高重复性。冷冻保存后得到的结果与没有冷冻保存时得到的结果非常相关,优化后得到了高灵敏度,非特异性背景很低,能可靠地检测到Bp抗原特异性Th1、Th2和Th17型CD4+ T细胞,最低比例范围为0.01%-0.03%。
冷冻保存.jpg

所以,大家可以试试。


信源:Corbière V, Lambert EE, Rodesch M, van Gaans-van den Brink JAM, Misiak A, Simonetti E, Van Praet A, Godefroid A, Diavatopoulos DA, van Els CACM, Mascart F; PERISCOPE WP5 Task 7 working group. A semi high-throughput whole blood-based flow cytometry assay to detect and monitor Bordetella pertussis-specific Th1, Th2 and Th17 responses. Front Immunol. 2023 Feb 6;14:1101366. doi: 10.3389/fimmu.2023.1101366. PMID: 36814927; PMCID: PMC9939445.

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发表于 2023-3-20 16:00:45 | 显示全部楼层
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 楼主| 发表于 2023-3-20 16:49:14 | 显示全部楼层
Chemericcat 发表于 2023-3-20 16:00
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上面讲的是测胞内因子,并不是分泌到血浆/血清中的细胞因子,后者的试剂可不止这一家,很多。
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