关于肿瘤细胞的流式凋亡检测

xianluobo

各位老师好，经过学习后第一次进行流式凋亡检测，试剂盒用的Elabscience，有几个问题想请教一下，实验过程和结果图如下：

图搞了好几次都上传失败了，不知道老师们能看到吗

悬浮细胞种板后，分为实验组和对照组，实验组加药处理48h后回收细胞，离心洗涤，试剂盒孵育15分钟后上机检测。
1. 实验组空白未标
2. 对照组空白未标

3. 实验组单染PI

4.实验组单染Annexin V-APC

5. 实验组双染

6. 对照组双染

7. 用对照组的一孔试着60℃水浴了5min后双染，好像搞得不好

然后我的药物因为有颜色，处理后细胞也变色了，结果实验组空白不染的APC却分群了。然后立马用多余的实验组孔重新换了Annexin V-FITC，结果图如下：

8. 换后实验组单染PI

9. 换后实验组单染Annexin V-FITC

10. 换后实验组双染

现在我有以下问题需要各位老师解答~

Q1. 补偿不太会调，是在标PI的时候调APC/FITC使细胞都在阴性门吗，图8和9的细胞总向上飘出一个尖尖，怎么拉补偿都不消失，但是标PI和APC的时候就没出现尖

Q2. 对照组早凋晚凋加起来20%左右，是不是太高了，这会是什么原因？

Q3. UNGATE都收了20000细胞，P1圈门的时候，实验组的细胞碎片比对照组多很多，这会是药物作用的药物作用的一部分吗，镜下看实验组也是碎的要多一些~这部分应该做什么检测比较好？

谢谢各位老师！！

xianluobo

图7、8如下~

niwanmao

看这些问题，以及做图的方式，应该是位新手。

首先，药物在APC有荧光，应放弃Annexin V APC，而是改用FITC的。
其次，凋亡率高低，跟你平时培养好坏有关，如对照组凋亡率偏高，得从细胞培养上下功夫。
最后，收集细胞数，应以P1门内细胞数量为准，应将收集标准为P1门内20000个细胞。

xianluobo

niwanmao 发表于 2023-3-9 20:17
看这些问题，以及做图的方式，应该是位新手。

首先，药物在APC有荧光，应放弃Annexin V APC，而是改用FITC ...

谢谢倪老师！确实是新手，有好多弄不明白
我这次可能细胞种的太密，48h培养基黄的厉害，下次试试稀一点~

wxd

最近看到一篇很有意思的文献，对你的实验会有帮助的

xianluobo

wxd 发表于 2023-3-10 08:40
最近看到一篇很有意思的文献，对你的实验会有帮助的

谢谢老师，学习到了~确实是从冰箱拿出来试剂盒直接用了，没有考虑这个影响