流式细胞术做蛋白磷酸化检测遇到的难题

dongfangyao

各位老师好，
我这周用人PBMC尝试了两次流式磷酸化蛋白检测，无论是论坛里提到的用终浓度1-2%PFA固定+100%甲醇破膜 还是  BD 商品化的固定+破膜组合kit，在用PBS清洗剩余甲醇的时候会遇到细胞粘在1.5mlEP管壁上的情况，振荡和枪头吹都无济于事，仅用枪头刮可以刮落，但细胞无法全部下来，丢失严重，只能放弃染色和上机。

我这里描述下第二次尝试的处理过程：EP管中200ul/100w 体系 进行刺激，1h后，加入500ul 固定(BD fixation 554655)，37℃ 10min，后离心，转移至流式管，2mlPBS重悬清洗；
松散沉淀后加入预冷1ml perm3(主要成分是甲醇)，振荡，冰上30min；
加入4ml PBS重悬，离心去上清，这里为了后面染色方便，我把细胞沉淀(是的这一步，流式管底还能明显看到细胞颗粒)转移至1.5mlEP管，加入1mlPBS进行第二次清洗，离心完就发现，细胞全在壁上了。

我想不明白是什么原因，EP管的材质更容易吸附固定破膜后的细胞么？但以往胞内核内的染色都在EP管进行的。
难不成是甲醇没洗干净？但是流式管中还能看得见沉淀。

请各位老师，指点迷津！

niwanmao

粘壁上，我想到的是离心后沉淀平铺于侧壁，是吧？

这大多是细胞状态出了问题，我怀疑是不是前面固定那步，为什么在刺激完，不先洗涤掉，再进行室温固定？

dongfangyao

niwanmao 发表于 2023-4-28 07:46
粘壁上，我想到的是离心后沉淀平铺于侧壁，是吧？

这大多是细胞状态出了问题，我怀疑是不是前面固定那步， ...

谢谢倪老师的回复，
因为之前看了倪老师您在论坛分享的一篇methods的文献，他就是用高浓度的PFA直接加入的，我考虑的就是这样操作可以保留即时的磷酸化状态？
倪老师您是觉得是没准确固定引起的么，但是在转移至EP管之前，流式管中细胞还是不沾壁可以离心下来

悠游

在加入甲醇破膜前，多增加一次PBS清洗呢？

dongfangyao

我现在就是 全部  都在流式管里操作，最后上机能检测到细胞；
但是！ 因为我所有抗体都是在甲醇破膜后加入的，除了CD3  CD4 CD8 CD19都没染出来...