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[功能检测] anti-CD3/28的抗体刺激PBMC后,进行常规表型分析,CD3检测抗体标记不上

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发表于 2023-4-29 15:26:27 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
本帖最后由 dongfangyao 于 2023-4-29 15:30 编辑


各位老师,其实这个问题我们实验室都有遇到过,但还是想问问各位老师有没有好的解决方法:

实验:用anti-CD3/CD28抗体刺激PBMC后,CD3流式检测抗体标记不上;
条件:刺激用的CD3抗体为OKT3,检测用的我们试过同克隆和不同克隆,都无法分出CD3+阳性的细胞群;

除了改用CD3/28磁珠进行刺激的方法之外,在用anti-CD3/CD28抗体刺激的前提下,有没有比较好的方式能够分出CD3+的T细胞群体(虽然只用CD4 CD8也可以分出T)
求助!

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发表于 2023-4-30 10:00:42 | 显示全部楼层
我仅从理论上给点建议,是否可行需要实践确认。

如果可溶性CD3刺激后,导致细胞表面完全被CD3抗体结合,此时,可考虑用结合该CD3抗体的二抗(例如可溶性CD3是鼠抗人,那么二抗可选择兔抗鼠),染好二抗之后,再做其它位点的直标。
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 楼主| 发表于 2023-5-2 22:30:16 | 显示全部楼层
好的谢谢倪老师!  我想,如果刺激用的抗体的种属与其它要使用的流式抗体的种属不一致,是不是二抗可以和这些直标的流式抗体一起染~
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发表于 2023-5-3 10:02:30 | 显示全部楼层
dongfangyao 发表于 2023-5-2 22:30
好的谢谢倪老师!  我想,如果刺激用的抗体的种属与其它要使用的流式抗体的种属不一致,是不是二抗可以和这 ...

有些二抗可能会有交叉结合能力,所以尽量分开染吧。
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发表于 2023-5-8 20:51:08 | 显示全部楼层
我也遇到过同样的问题。
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 楼主| 发表于 2023-5-22 10:53:07 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2023-5-3 10:02
有些二抗可能会有交叉结合能力,所以尽量分开染吧。

老师关于流式二抗的实验,还有个问题想问您,我先描述下结果:
一抗是我们自己做的,目前是人IgG1的Fc端,用的二抗就是anti-human IgG Fc的PE抗体,然后我用这个取检测全血中免疫细胞表达情况(其它谱系marker都是商品化的,都是小鼠和大鼠来源),结果就是
1.单独二抗加进去,单核全阳,粒细胞B细胞部分结合(二抗是大鼠来源,B细胞有结合应该是因为成熟B细胞表面的IgG);
2.加了商品化纯化IgG1的ISOtype NK细胞也有阳性;
3.为什么没有封闭,是因为商品化的人Fcblock也/是用的人IgG,block之后加入二抗会导致细胞全阳;
问题:
我想通过加入anti-CD16 32 64的抗体组合(类似小鼠的商品block)来消除上述的非特异结果(先不考虑B),这个方法可不可行?或者老师您有没有更好的建议,以及对上述的1 2 3结果有没有其它理解。
因为二抗能放大信号还是想说用这种方式,对于B的检测打算给一抗连个生物素,生物素分子i小不大影响抗体功能(PE等较亮荧光蛋白分子量很大)
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发表于 2023-5-23 11:15:43 | 显示全部楼层
dongfangyao 发表于 2023-5-22 10:53
老师关于流式二抗的实验,还有个问题想问您,我先描述下结果:
一抗是我们自己做的,目前是人IgG1的Fc端 ...

楼主有没有试过 二抗 anti human IgG Fab段的,如果商品化的human FC block只是FC段的话,是不是就能错开了?   然后有没有试过CD28的流式抗体呢,也染不出来吗,二抗的即时得出的结果,理论上是不是CD3 AND CD28 的阳性结果
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发表于 2023-5-23 11:22:57 | 显示全部楼层
Adam2022 发表于 2023-5-23 11:15
楼主有没有试过 二抗 anti human IgG Fab段的,如果商品化的human FC block只是FC段的话,是不是就能错开 ...

突然想到,你也可以尝试换用anti TCR α/β来定义总T呢?
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 楼主| 发表于 2023-6-2 22:15:18 | 显示全部楼层
Adam2022 发表于 2023-5-23 11:15
楼主有没有试过 二抗 anti human IgG Fab段的,如果商品化的human FC block只是FC段的话,是不是就能错开 ...

anti-Fab的二抗会有么,这个不同的抗体得特殊定制?
emm这个问题里提到的“我们自己做的一抗”不是针对CD3/28
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发表于 2023-6-9 08:59:16 | 显示全部楼层
dongfangyao 发表于 2023-6-2 22:15
anti-Fab的二抗会有么,这个不同的抗体得特殊定制?
emm这个问题里提到的“我们自己做的一抗”不是针对CD ...

我没做过相关试验,不过刺激后进行酸化,使抗体结合分开,再重染是否可行?
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