anti-CD3/28的抗体刺激PBMC后，进行常规表型分析，CD3检测抗体标记不上

dongfangyao

各位老师，其实这个问题我们实验室都有遇到过，但还是想问问各位老师有没有好的解决方法：

实验：用anti-CD3/CD28抗体刺激PBMC后，CD3流式检测抗体标记不上；
条件：刺激用的CD3抗体为OKT3，检测用的我们试过同克隆和不同克隆，都无法分出CD3+阳性的细胞群；

除了改用CD3/28磁珠进行刺激的方法之外，在用anti-CD3/CD28抗体刺激的前提下，有没有比较好的方式能够分出CD3+的T细胞群体(虽然只用CD4 CD8也可以分出T)
求助！

niwanmao

我仅从理论上给点建议，是否可行需要实践确认。

如果可溶性CD3刺激后，导致细胞表面完全被CD3抗体结合，此时，可考虑用结合该CD3抗体的二抗（例如可溶性CD3是鼠抗人，那么二抗可选择兔抗鼠），染好二抗之后，再做其它位点的直标。

dongfangyao

好的谢谢倪老师！  我想，如果刺激用的抗体的种属与其它要使用的流式抗体的种属不一致，是不是二抗可以和这些直标的流式抗体一起染~

niwanmao

dongfangyao 发表于 2023-5-2 22:30
好的谢谢倪老师！  我想，如果刺激用的抗体的种属与其它要使用的流式抗体的种属不一致，是不是二抗可以和这 ...

有些二抗可能会有交叉结合能力，所以尽量分开染吧。

JenniferLiu

我也遇到过同样的问题。

dongfangyao

niwanmao 发表于 2023-5-3 10:02
有些二抗可能会有交叉结合能力，所以尽量分开染吧。

老师关于流式二抗的实验，还有个问题想问您，我先描述下结果：
一抗是我们自己做的，目前是人IgG1的Fc端，用的二抗就是anti-human IgG Fc的PE抗体，然后我用这个取检测全血中免疫细胞表达情况(其它谱系marker都是商品化的，都是小鼠和大鼠来源)，结果就是
1.单独二抗加进去，单核全阳，粒细胞B细胞部分结合(二抗是大鼠来源，B细胞有结合应该是因为成熟B细胞表面的IgG)；
2.加了商品化纯化IgG1的ISOtype NK细胞也有阳性；
3.为什么没有封闭，是因为商品化的人Fcblock也/是用的人IgG，block之后加入二抗会导致细胞全阳；
问题：
我想通过加入anti-CD16 32 64的抗体组合(类似小鼠的商品block)来消除上述的非特异结果(先不考虑B)，这个方法可不可行?或者老师您有没有更好的建议，以及对上述的1 2 3结果有没有其它理解。
因为二抗能放大信号还是想说用这种方式，对于B的检测打算给一抗连个生物素，生物素分子i小不大影响抗体功能(PE等较亮荧光蛋白分子量很大)

Adam2022

dongfangyao 发表于 2023-5-22 10:53
老师关于流式二抗的实验，还有个问题想问您，我先描述下结果：
一抗是我们自己做的，目前是人IgG1的Fc端 ...

楼主有没有试过 二抗 anti human IgG Fab段的，如果商品化的human FC block只是FC段的话，是不是就能错开了？   然后有没有试过CD28的流式抗体呢，也染不出来吗，二抗的即时得出的结果，理论上是不是CD3 AND CD28 的阳性结果

Adam2022

Adam2022 发表于 2023-5-23 11:15
楼主有没有试过 二抗 anti human IgG Fab段的，如果商品化的human FC block只是FC段的话，是不是就能错开 ...

突然想到，你也可以尝试换用anti TCR α/β来定义总T呢？

dongfangyao

Adam2022 发表于 2023-5-23 11:15
楼主有没有试过 二抗 anti human IgG Fab段的，如果商品化的human FC block只是FC段的话，是不是就能错开 ...

anti-Fab的二抗会有么，这个不同的抗体得特殊定制？
emm这个问题里提到的“我们自己做的一抗”不是针对CD3/28

悠游

dongfangyao 发表于 2023-6-2 22:15
anti-Fab的二抗会有么，这个不同的抗体得特殊定制？
emm这个问题里提到的“我们自己做的一抗”不是针对CD ...

我没做过相关试验，不过刺激后进行酸化，使抗体结合分开，再重染是否可行？