Cytokine的Surface为什么会出现这两种奇怪的细胞群？

科研废物

各位老师，我最近在做小鼠外周血NK cell杀伤性细胞因子的检测，使用自配ACK裂红后给予50ng/mL的PMA，1ug/mL的Ionomycin刺激，并使用BD的Golgi Stop按照1:1000的比例进行阻断，刺激后进行Surface和Cytokine的染色，使用BD的cytofix/Prem的kit进行破膜和固定，每次染完都会出现一群往右上角偏离的奇怪的峰，这是死细胞的自发荧光还是什么其他的荧光呢？通过补偿也调不回来，请各位老师指点！不胜感激！

niwanmao

左图CD3异常增高，可能是染料粘连等原因引起的非特异性信号（也可能其它未知的原因）。
右图阴性群的SD大，是较常见的，可考虑从抗体滴定上下功夫。

科研废物

niwanmao 发表于 2023-5-9 20:32
左图CD3异常增高，可能是染料粘连等原因引起的非特异性信号（也可能其它未知的原因）。
右图阴性群的SD大， ...

倪老师您好，请问这种情况是CD3的抗体浓度偏大导致的吗？
麻烦您再看一下figure 1，是不是也是SD群偏大，需要调整抗体浓度？

但是奇怪的是，只有cytokine的surface会出现这种情况，如果单染surface，不破膜的话细胞群还算正常（如figure 2）

悠游

你之前的圈门排除了死细胞和黏连细胞了吧？固定破膜前，染完表面抗体后洗了吗？

科研废物

悠游 发表于 2023-5-10 08:46
你之前的圈门排除了死细胞和黏连细胞了吧？固定破膜前，染完表面抗体后洗了吗？ ...

老师您好，去过死细胞和黏连细胞了。之前也以为是染完表面后洗的不干净，后面在固定破膜前尝试洗两遍，发现还是会有

悠游

科研废物 发表于 2023-5-10 10:02
老师您好，去过死细胞和黏连细胞了。之前也以为是染完表面后洗的不干净，后面在固定破膜前尝试洗两遍，发 ...

那你固定破膜多长时间？这部分可能也需要摸索，同一样本是否破膜对细胞群（如NK）的比例影响变化大吗？
然后就像倪老师说的，看一下抗体滴定的问题；实在不行，就多封闭一下

niwanmao

科研废物 发表于 2023-5-9 20:53
倪老师您好，请问这种情况是CD3的抗体浓度偏大导致的吗？
麻烦您再看一下figure 1，是不是也是SD群偏大， ...

明白了，这是固定、破膜后出现的。这很正常，固定、破膜，会造成表面蛋白构象发生改变，特别容易产生非特异性本底。

科研废物

niwanmao 发表于 2023-5-10 11:01
明白了，这是固定、破膜后出现的。这很正常，固定、破膜，会造成表面蛋白构象发生改变，特别容易产生非特 ...

那这个是抗体决定的还是细胞表面marker决定的呢？还是有一定概率会出现这种情况呢？这群细胞会影响后续的分析吗？

niwanmao

科研废物 发表于 2023-5-10 17:05
那这个是抗体决定的还是细胞表面marker决定的呢？还是有一定概率会出现这种情况呢？这群细胞会影响后续的 ...

所有的固定、破膜步骤，均会出现。
这是由目前所用的固定、破膜剂决定的。
只要做好FMO对照（经过相同的固定破膜处理）即可。

科研废物

niwanmao 发表于 2023-5-10 21:10
所有的固定、破膜步骤，均会出现。
这是由目前所用的固定、破膜剂决定的。
只要做好FMO对照（经过相同的 ...

明白了 谢谢老师