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[其它] 流式如何检测细胞 胞吞大分子药物

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发表于 2023-5-11 16:25:22 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
大家好,大分子抗体药物,例如靶向细胞表面CD3分子,如何检测T细胞有没有胞吞该药物呢?有没有老师用流式做过类似实验或者设计呢,谢谢

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发表于 2023-5-11 19:51:21 | 显示全部楼层
未做过,仅从理论上进行探讨:
是否可用结合该抗体药物的荧光素二抗,结合上去检测。但是因为是要检测胞吞作用,所以做一管常规染色的,反映结合表面的;再做一管固定、破膜的,同时反映表面和胞内的。
两者相减,相当于是被胞吞到胞内的抗体药物水平。
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发表于 2023-5-12 08:33:52 | 显示全部楼层
可以给这个抗体连上荧光标签,跟细胞共培养之后用流式或者酶标仪检测荧光强度。最好做个时间梯度或者浓度梯度,以排除表面结合。
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发表于 2023-5-12 09:11:54 | 显示全部楼层
我也没什么经验,不过感觉上思路可以如下

首先不知道你是要直接检测样本还是做体外实验:

检测样本的话,感觉可以按照倪老师提供的方案进行方法开发,当然你需要先筛选到合适的二抗。
动物样本比较方便,使用抗人的Fc抗体应该就行;如果是临床样本的话,抗体筛选可能需要麻烦一点,同时要注意封闭。

做体外实验的话,可以用荧光素直标药物与细胞共培养,然后二抗染表面。
以上思路仅供参考。
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 楼主| 发表于 2023-5-12 09:12:00 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2023-5-11 19:51
未做过,仅从理论上进行探讨:
是否可用结合该抗体药物的荧光素二抗,结合上去检测。但是因为是要检测胞吞 ...

老师好,如果表变结合药物很多,,荧光强度很高,然后由固定破膜引起的表面荧光强度改变,会不会很可能会比胞内染色增加的荧光强度要大?
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 楼主| 发表于 2023-5-12 09:16:17 | 显示全部楼层
wxd 发表于 2023-5-12 08:33
可以给这个抗体连上荧光标签,跟细胞共培养之后用流式或者酶标仪检测荧光强度。最好做个时间梯度或者浓度梯 ...

表面是个高表达靶点,表面的信号强度会很大,如果不除去表面的信号,如果不是大量胞吞,信号差异可能反映不出来。
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 楼主| 发表于 2023-5-12 09:23:35 | 显示全部楼层
悠游 发表于 2023-5-12 09:11
我也没什么经验,不过感觉上思路可以如下

首先不知道你是要直接检测样本还是做体外实验:

体外实验,只表染可能不行,即使会胞吞,药物量除非刚刚好够表面抗原结合的量,若是多一些,即使胞吞了,表面结合的药物分子也不会比胞吞后少,会是在一个大致的水平
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发表于 2023-5-12 09:47:28 | 显示全部楼层
赤道与北极 发表于 2023-5-12 09:12
老师好,如果表变结合药物很多,,荧光强度很高,然后由固定破膜引起的表面荧光强度改变,会不会很可能会 ...

如果胞吞量比较少,可能需要通过荧光显微镜观察了。
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发表于 2023-5-12 10:00:08 | 显示全部楼层
赤道与北极 发表于 2023-5-12 09:23
体外实验,只表染可能不行,即使会胞吞,药物量除非刚刚好够表面抗原结合的量,若是多一些,即使胞吞了, ...

可以用荧光显微镜或者激光共聚焦,二抗用不同颜色的荧光,然后两种荧光图片叠加,分析胞吞比例
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发表于 2023-5-17 17:46:43 | 显示全部楼层
如果固定破膜的方式,担心固定前后荧光强度改变不好分析,可以样本一分为二管,用两种不同荧光的二抗分别检测,分析两管各自的数据。

如果不想做固定破膜,怕对膜表位或药物有影响,我想你的样本是体外给药后的对吧,可以将样本一分为二管,一管用 预先荧光标记的药物(相当于常规荧光抗体)染色[直标],阳性结果代表游离的CD3,另一管用抗药物的荧光二抗[间标],阳性结果代表表面占位上的药物,如果直标和间标都没有阳性检出,反映靶点内吞,具体内吞率你可以参考这个逻辑算一算,应该可行的。
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