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要做好流式实验,以下优化、对照、保障措施需谨记

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发表于 2023-5-14 19:48:25 | 显示全部楼层 |阅读模式

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正确的对照、质量保证,对于“良好的流式细胞术实践”是必不可少的,没有它,就不可能稳健地生成和分析数据或解释实验结果。任何流式实验,务必要记得以下三方面保障措施。
一、设置/仪器对照/质量保证
设置/仪器对照/质量保证使仪器能够在安装时以及随后的时间内正确设置。任何流式细胞仪设备的一个重要组成部分是仪器的定期维护和质量对照(QC)。这种过程的基本目的不仅是确保仪器工作正常,而且是确保纵向稳定性。广义地说,这些过程可以分为三个关键步骤:

优化
检查一系列重要的仪器参数:滤光器的效率和性能、二向色镜的反射和透射、激光定时(激光延迟)、激光功率、采集仪器信号的时间长度(如window extension)、放大器线性度、电子噪声、面积和峰高信号的同步(如面积比例因子)

校准
包括测量/监控每个光电倍增管(PMT)(例如检测器)的动态范围和光子效率。这可以使用稳定的硬染色荧光微球(制造商提供的,或第三方如Rainbow微球)来实现。推荐使用四种类型的微球:QuantumTM Simply Cellular® beads (QSCBs)、CytoCal beads (or Duke beads)、单峰Rainbow beads、补偿微球 (COMP beads)

标准化
每天跟踪再现性和可靠性,以识别现有和潜在的问题。每日监测记录应以电子方式保存,以便更好地跟踪趋势和与既定可接受性能范围和光学背景的差异。
这些质量保证流程确保仪器的正确和(至关重要的)可再现性能,并确保检测到的样品中的任何差异/变化都是由真实的生物事件引起的,而不是仪器问题。


二、特异性(设门)保证
特异性/设门对照可将特异性染色与非特异性染色区分开来,也用于建立用于识别感兴趣的细胞群体的门和区域。这些对照对于确定阳性和阴性群体以及给定标记的表达强度(如果这是实验设计的一部分)是至关重要的。

单一染色对照
用于为常规流式细胞仪中使用的荧光色素方案设置正确的补偿值。
对于光谱流式细胞术,使用光谱去卷积(解混合)算法,单一染色样品可用于确定混合样品中每个荧光素的贡献。
重要的是,对照的荧光“亮度”要与实验样品一样亮或更亮,不同群体的背景荧光是等效的,用于对照和样品值的荧光色素以及用于分析这些群体的仪器设置是相同的。
同样重要的是,群体的自发荧光要相同,并且收集了足够的事件。如果不包括这些必要的对照,就不可能解释多参数流式细胞术的数据。

未染色/自发荧光对照
能够控制背景自发荧光。可以是未染色的细胞,也可以是已知不表达任何抗原(方案中抗体相关)的细胞。应该认识到,自发荧光可以随着“生物学”而变化,因此应该对所有未处理或已处理样本,设置相应的对照。

活细胞染色
当分析样品时,活细胞染色是必不可少的,因为无活力(死亡)细胞更有可能非特异性结合Abs,并且更高度自发荧光。因此,去除死细胞,能够更明确地鉴定真正的阳性和真正的阴性群体。

设门对照
设门是正确识别感兴趣群体的关键。尽管这些方法多年来一直基于使用同型对照,但这种方法已在很大程度上被“荧光减1(FMO)”方法所取代。FMO对照识别荧光色素进入感兴趣通道的光谱渗漏。

非特异性结合
非特异性结合对流式细胞术测量的灵敏度有负面影响,因此必须最小化。
在许多情况下,isoclonic对照有助于明确荧光素抗体是否会与样本发生非特异性结合,就是在存在过量相同未标记抗体的同时加入荧光素抗体,此时,未标记的抗体占据所有的结合位点,阻止荧光标记抗体的特异性结合,因此,检测到的任何信号均来自非特异性结合。
尽管有些人继续使用同型对照来确定/排除非特异性结合,但同型对照通常并不有用。对于分析表达Fc受体的细胞的流式实验,可以使用许多不同的阻断剂(“Fc阻断剂”)或使用已被设计成不表达Fc部分的重组抗体,从而减少非特异性结合。


三、生物学对照/实验对照
生物学对照/实验对照很重要,反映了未刺激/处理和刺激/处理组之间的差异,对于确定处理或条件是否诱导了感兴趣细胞群相关指标真实变化是必不可少的。根据实验问题和设计,适合设门参照。
这种参照同时也能用于分析和/或仪器稳定性。如果这种参考对照“失败”,那么在进行实验之前,应该采取适当的补救措施。
往细了说,生物学对照/实验对照包括已知缺失或表达相关抗原的细胞、敲除或转染相关抗原的细胞、用商品化稳定试剂处理的细胞等等。

信源:Cossarizza A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition). Eur J Immunol. 2021 Dec;51(12):2708-3145. doi: 10.1002/eji.202170126. Epub 2021 Dec 7. PMID: 34910301.
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2023-6-30 22:33:41 | 显示全部楼层
老师,做TH17检测,抗体用IL17,生物学阴性对照可否选择未加刺激阻断剂之前的细胞作为阴性对照?
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 楼主| 发表于 2023-7-1 07:43:16 来自手机 | 显示全部楼层
lukequ 发表于 2023-6-30 22:33
老师,做TH17检测,抗体用IL17,生物学阴性对照可否选择未加刺激阻断剂之前的细胞作为阴性对照? ...

可以,但是可能会有少量IL17+的信号
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2023-7-12 09:05:33 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2023-7-1 07:43
可以,但是可能会有少量IL17+的信号

老师,染TH17,空白对照和用于调补偿的CD4单染管是否也需要固定破膜处理。
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