Calcein AM, PI 法测死活

魂断蓝桥

1、Calcein AM, PI 法测量细胞的死活后，没有时间上机，可以使用4%PFA固定后，过夜，再上机检测吗？

2、虽然不建议这样搞，不能这样做，是什么原因呢。有小伙伴知道嘛

wmj123456

PI染死细胞，如果细胞被固定后，就全部死了，此时PI全部是阳性了，也无法区分死活了。

魂断蓝桥

wmj123456 发表于 2023-5-25 22:47
PI染死细胞，如果细胞被固定后，就全部死了，此时PI全部是阳性了，也无法区分死活了。 ...

我已经染色完成，然后洗涤干净了。加入PFA固定。

悠游

魂断蓝桥 发表于 2023-5-26 08:36
我已经染色完成，然后洗涤干净了。加入PFA固定。

我是新手，请教一下洗多少次算是洗涤干净了？平时抗体上机前洗一次可以吗？已经染上的PI会继续破坏细胞吗？

wxd

让我们来复习一下钙黄绿素的染色原理：活细胞的特征是无处不在的细胞内酯酶活性，Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein，聚阴离子染料Calcein很好地保留在活细胞内，几乎无荧光的Calcein-AM转变为绿色荧光的Calcein，因不具有细胞膜透性，被留在活细胞中发出均匀的强绿色荧光。（懋康生物，货号：MX3011）。
注意这个“因不具有细胞膜透性，被留在活细胞中发出均匀的强绿色荧光”这句话，说的是活细胞。固定后的细胞是死细胞，是全透的，无法阻止荧光基团的外泄，另外这一夜细胞是在固定液中放置的，上机前还需要清洗，肯定会把荧光全洗掉的。因此不建议固定后过夜上机检测。

hezeljgouc

PI也存在同样的问题，它和双链DNA的结合是非共价结合，可以被洗脱下来，所以一般使用PI染色的实验中都是不洗涤直接上样。你如果先洗涤了细胞，再固定过夜的话，结合在死细胞DNA上的PI不能保留在细胞中；而如果不洗涤直接固定，那所有细胞都死了，可能都会被PI染色。因此不建议固定过夜后上机检测。