树突状细胞与T细胞共培养

lqyfimmu

最近在做小鼠骨髓来源的树突状细胞与脾脏分离的CD4+T细胞共培养实验，检测T细胞的分化。做流式染色的时候发现CD4标记荧光强度很低，并且培养3天后死细胞很多，请问大家有遇到类似的问题吗？该如何改进共培养方案？

wxd

楼主能说一下具体的细节吗？比如：
用的U型板还是平底板？
DC是不是经过活化刺激？有没有验证DC的活化指标？
DC和T细胞的比例？
培养基中有没有添加T细胞生存必须的IL-2或者其他刺激物？
流式染色检测的指标是T细胞活化类还是T细胞受体类？

lqyfimmu

wxd 发表于 2023-6-15 17:07
楼主能说一下具体的细节吗？比如：
用的U型板还是平底板？
DC是不是经过活化刺激？有没有验证DC的活化指标 ...

1.        同品系未处理小鼠脾脏细胞CD4磁珠阳性分选得到T细胞，加入CD3/CD28【工作浓度1ug/ml】、IL-2【工作浓度：25ng/ml】培养1-2天【96孔U底板，10^5/100ul】。
2.        DCs经抗原刺激后，收集洗涤，加入96孔U底板与分选出来的T细胞共培养3天【DC:T=10^4:10^5，DC：10^4/100ul，T：10^5/100ul】。
以上是对两种共培养细胞的处理，感谢各位老师、同仁帮忙解答！

wxd

这个培养条件按理说不应该出现大量死细胞的。要不你试试细胞分选出来直接与DC共培养，相应的细胞因子还加上。
根据经验，CD4+T细胞在受到刺激之后，确实可能会染不上（转到细胞内了），需要胞内染色才行。
其次，T细胞的活化在受到抗原提呈细胞的刺激之后就开始了，3个小时后就会表达CD69等活化指标。有可能的话楼主可以这个时候检测。

CBJ

CD4阳选的克隆号与流式检测的克隆号不能一样，否则也会造成检测不到

lqyfimmu

wxd 发表于 2023-6-16 15:33
这个培养条件按理说不应该出现大量死细胞的。要不你试试细胞分选出来直接与DC共培养，相应的细胞因子还加上 ...

好的，感谢友友的解答！

lqyfimmu

CBJ 发表于 2023-6-16 15:54
CD4阳选的克隆号与流式检测的克隆号不能一样，否则也会造成检测不到

我用的是CD4阳选磁珠，说明说上明确说不影响后续的流式抗体染色，对CD4表位的影响不大呢。