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设计荧光流式多色方案的五步法

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发表于 2023-7-3 15:51:27 | 显示全部楼层 |阅读模式

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一、选择标记
  • 要分析什么目标群体,例如效应T细胞和记忆T细胞。
  • 定义目标群体的谱系标记物,例如CD3、CD8、CCR7、CD45RA。
  • 如需分析功能,则需增加功能性标志物,如PD-1、CTLA-4、CD69。
  • 了解标记物的预期抗原密度,例如低、中、高、极高。
  • 了解哪些群体会共表达哪些标记。


二、了解流式细胞仪配置
  • 搭配方案前,首先需了解你要使用的流式细胞仪,了解激光器和滤光片配置,知道可以使用哪些颜色,是否可以优化?
  • 记录单染微球,以创建溢出扩散矩阵 (SSM)。
  • 计算得到的SSM显示不同颜色通道溢出程度如何,并在SSM旁边标注上亮度或染色指数。


三、将颜色与标记进行匹配
  • 将标记放置在Excel中SSM颜色旁边,如为共表达的标记,务必避免放在荧光溢出大的颜色中。
  • 亮度高的颜色(即较大的染色指数)分配给表达密度低的抗原,反之亦然。


四、测试和优化
  • 如果有多个克隆号,需通过多种方式确定要使用哪个克隆(如文献、试用等)。
  • 检测并滴定抗体,确定最佳浓度(即染色指数最大,也就是意味着阳性群体最强且背景最低的平衡点)
    Positive.jpg
  • 可能需要特定的细胞系或刺激后的细胞作为阳性样本。
  • 用全染的细胞进行评价。如发现问题,进行方案变更。

此时的SSM表格应该如下图所示:
SSM.jpg

五、应用方案
  • 使用单染微球或细胞创建补偿。确保补偿在全染细胞上能产生令人满意的结果。
  • 请注意补偿后的设置和 PMT 值不应改变。
  • 使用手动逐级设门分析流式数据,或探索性分析无监督聚类方法。


信源:Holmberg-Thyden S, Grønbæk K, Gang AO, El Fassi D, Hadrup SR. A user’s guide to multicolor flow cytometry panels for comprehensive immune profiling. Anal Biochem. 2021;627:114210.

组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2024-3-28 10:38:25 | 显示全部楼层
倪老师您好,请教一下哈,这个SSM表要先用所有颜色的beads(APC、APC-R700、APC-Cy7、BUV395、BUV737、BV421、BV480、BV650、BV711、BV786、FITC、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy7)在流式仪上跑一遍补偿得到荧光溢出的吗?
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
 楼主| 发表于 2024-3-28 10:41:59 | 显示全部楼层
baron 发表于 2024-3-28 10:38
倪老师您好,请教一下哈,这个SSM表要先用所有颜色的beads(APC、APC-R700、APC-Cy7、BUV395、BUV737、BV42 ...

是的
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发表于 2024-3-28 10:50:43 | 显示全部楼层

好的,谢谢
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