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[凋亡检测] 线粒体膜电位检测jc-1阳性对照和阴性对照没啥区别

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发表于 2023-9-11 11:52:14 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
我的实验是做的海洋动物鳃细胞,用的碧云天增强型试剂盒,345是阴性对照(取下组织室温消化20min,然后加jc-1避光孵育20min上机流式),789是阳性对照(取下组织室温消化20min,加入cccp细胞中浓度10um,然后加jc-1避光孵育20min上机流式),我的问题是阳性对照并不是很明显,不知道是什么原因,到底是操作问题还是流式采集参数设置问题。

阴性3

阴性3

阴性4

阴性4

阴性5

阴性5

阳性7

阳性7

阳性8

阳性8

阳性9

阳性9

jc-1.rar

5.72 MB, 下载次数: 2

jc-1检测文件

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发表于 2023-9-12 08:40:08 | 显示全部楼层
JC-1染色步骤是按照该试剂盒说明书吗?
看起来只有阳性9的群体比较明显,右侧有一个相对较明显的凋亡群体(虽未完全分开,但可看的到)。

是否存在样本操作的不稳定?
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发表于 2023-9-12 10:03:58 | 显示全部楼层
线粒体膜电位的结果分析,很难用横平竖直的十字门来进行分析,比较普遍的是将UR和LR之间的那条线画成斜向上的。你可以尝试一下这个画门方法。
不行的话,可能需要做JC-1的染色时间的染色条件优化。我之前用小鼠细胞系做的效果比较好的,JC-1的染色时间是一个小时左右。你做的是海洋动物腮细胞,染料自由扩散进入细胞内部的速度等可能和陆地上的动物不太一样。
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 楼主| 发表于 2023-9-12 11:02:38 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2023-9-12 08:40
JC-1染色步骤是按照该试剂盒说明书吗?
看起来只有阳性9的群体比较明显,右侧有一个相对较明显的凋亡群体( ...

您好老师,基本上是按照说明书来的,就是孵育温度没有按照说明书那个来,因为我的这个物种承受不了37度所以就按室温孵化的,我又换了种方法,之前是胰酶消化这回直接是机械捶打下来的。目前的问题主要有以下问题:1、很多信号在x轴下面调节对应通道的电压(b585)也无法解决2、染剂会有一些红色絮状颗粒不知道会不会对结果有影响(温浴,超声促融都试了)3、目前流式采集参数还有哪些需要改进的,我害怕是流式没调明白
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 楼主| 发表于 2023-9-12 11:09:44 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2023-9-12 08:40
JC-1染色步骤是按照该试剂盒说明书吗?
看起来只有阳性9的群体比较明显,右侧有一个相对较明显的凋亡群体( ...

今天换了种方法,这是今天跑的阴性对照,会看到,有一些细胞在x轴下面,调对应电压(b585)电压也不好使,在一个阴性对照竟然有很多下降的,不知道是我操作的问题还是流式调节的问题

今天跑的阴性对照

今天跑的阴性对照

空白对照未加任何染剂

空白对照未加任何染剂
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 楼主| 发表于 2023-9-12 11:16:02 | 显示全部楼层
wxd 发表于 2023-9-12 10:03
线粒体膜电位的结果分析,很难用横平竖直的十字门来进行分析,比较普遍的是将UR和LR之间的那条线画成斜向上 ...

您好,我这个门就是先大概看一下趋势,我们海洋动物首先没有完善的细胞系,只能用原代培养的和传一俩代的做,还得调节渗透压,参考的是类似的物种类似的细胞

参考文献

参考文献
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发表于 2023-9-12 12:32:13 | 显示全部楼层
龙少1942 发表于 2023-9-12 11:02
您好老师,基本上是按照说明书来的,就是孵育温度没有按照说明书那个来,因为我的这个物种承受不了37度所 ...

胰酶消化的时间、机械吹打的力度,可能是都是影响因素。

至于絮状颗粒,是由于JC-1加入的时候,你应该未进行边振荡边滴加的形式吧?既需要充分振荡,又不能太剧烈。参见:
流式细胞术检测凋亡方法1-罗丹明123、DiOC6(3)、JC-1染色
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-191-1-1.html
(出处: 流式中文网)
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发表于 2023-9-13 16:07:31 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2023-9-12 08:40
JC-1染色步骤是按照该试剂盒说明书吗?
看起来只有阳性9的群体比较明显,右侧有一个相对较明显的凋亡群体( ...

老师,想请教个问题,分析线粒体膜电位JC-1的时候FSC-A和SSC-A是否需要将坏死或凋亡的细胞圈上,就像分析凋亡PI和annexin,第一个前向侧向图除了碎片处的位置都圈上一样?
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发表于 2023-9-13 20:39:29 | 显示全部楼层
xuts 发表于 2023-9-13 16:07
老师,想请教个问题,分析线粒体膜电位JC-1的时候FSC-A和SSC-A是否需要将坏死或凋亡的细胞圈上,就像分析 ...

膜电位是早期事件,我个人建议不圈坏死或凋亡的细胞。坏死或凋亡的细胞可另外计算。这样的话,你呈现结果的时候,可给出:
正常细胞a%,线粒体膜电位降低的早早期凋亡细胞b%,Annexin V+的早期凋亡细胞c%,坏死或晚期凋亡的细胞d%。
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 楼主| 发表于 2023-9-14 11:13:12 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2023-9-12 12:32
胰酶消化的时间、机械吹打的力度,可能是都是影响因素。

至于絮状颗粒,是由于JC-1加入的时候,你应该未 ...

您好老师,请问阳性对照是这样是否合理,我延长了处理时间和浓度

cccp阳性对照

cccp阳性对照
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