心脏组织提取淋巴细胞

瓜瓜999

我们需要从心脏提取淋巴细胞，但是在组织处理过程中，以及最后结果一直都不太好。希望大家能够给一些建议~

心脏：
1.机械法处理 -->酶消化1h
2.40um strainer过筛，离心4℃/450g/10min。将上清移到另一个tube里再离心4℃/450g/10min，用1ml FACS buffer resuspend pellet  (之后放在冰上)
3.第二次离心后的上清弃掉，收集所有的pellet重悬
4.10ul cell suspension+90ul trypan blue，显微镜下观察。
（PS我们没有用RBC lysis buffer。之前用过，镜下发现细胞数量非常少）
问题：
①请问大家配好酶消化液后，放在室温还是冰上？因为我们每次需要取8/9个心脏，而且要先处理一下心脏，剪碎，再放在酶消化液里。一个一个心脏处理的话，直到把最后一个心脏放在消化液里，估计大概半小时。
②离心温度会影响淋巴细胞吗，我看有些protocol是室温，有些是4度离心
③显微镜下观察，发现有很多stuff，消化的碎片，镜下看起来有点脏。请问这是正常吗，还是酶消化液或者其他步骤有问题呢？

niwanmao

不知道你用了什么酶，可参考：
最完整的实体组织酶消化指导手册
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5834-1-1.html
(出处: 流式中文网)

瓜瓜999

niwanmao 发表于 2023-9-16 22:15
不知道你用了什么酶，可参考：
最完整的实体组织酶消化指导手册
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5834- ...

我们用了Collagenase I, XI, DNAse1, Hyaluronidase I-S, HEPEFS, DPBS作为酶消化液

niwanmao

瓜瓜999 发表于 2023-9-17 03:22
我们用了Collagenase I, XI, DNAse1, Hyaluronidase I-S, HEPEFS, DPBS作为酶消化液

对于心脏组织，前面我给你的链接里面，绝大多数都是用胶原酶2型。搜了下胶原酶的特性，2型更适合心脏之类的器官。

你是否再试试新条件，可消化后再加上机械解离？

瓜瓜999

niwanmao 发表于 2023-9-17 17:19
对于心脏组织，前面我给你的链接里面，绝大多数都是用胶原酶2型。搜了下胶原酶的特性，2型更适合心脏之类 ...

谢谢老师建议，我搜一下collagenase 2.
我们先把心脏用剪刀剪碎，酶消化之后，用注射器上的plunger在strainer上磨，使组织过滤下去

niwanmao

瓜瓜999 发表于 2023-9-19 03:07
谢谢老师建议，我搜一下collagenase 2.
我们先把心脏用剪刀剪碎，酶消化之后，用注射器上的plunger在str ...

步骤应该是可以的，消化酶、消化时间，这些条件我觉得再优化一下应该可以。