Nature Methods：从业者对光谱流式细胞术的看法

niwanmao

Siddhartha Sharma等人在2023年10月4日的Nature Methods杂志上发表了一篇Comment，题目是从业者对光谱流式细胞术的看法，讨论了光谱流式细胞术 (SFC) 的最佳实践和未来前景。

作者首先概述了 SFC 及其相对于传统流式细胞术的优势：
- 与传统流式细胞术相比，可检测的参数数量增加。
- 能够在单细胞水平上同时分析大量的细胞表面标记物。
- 能对免疫细胞及其功能进行深入表征。
- 提供单个细胞的高分辨率光谱测量。
因此SFC越来越受欢迎，在各个领域研究中具备丰富的潜在应用。

但是，作者话锋一转，SFC仍存在一些不足：
- 归一化可能具有挑战性，尤其是对于标记物表达存在细微差异的离散细胞群。还讨论了与归一化相关的技术挑战，并强调目前缺乏普遍满意的解决方案。他们建议对所有数据进行系统的统一归一化，并告诫不要过度解释热图和维度的可视化。
- 试剂的可用性有限。
- 背景细胞自发荧光可能干扰光谱解混。
- 由于参数数量较多，传统设门图在可视化 SFC 数据方面的局限性，因此提倡使用计算流式方法，如 UMAP 和 t-SNE 进行数据可视化。但是，他们提醒应谨慎使用这些方法。

使用时的注意点：
- 仪器校准和方案验证：作者强调了每次运行前仪器校准的重要性，以确保准确可靠的数据采集。他们建议使用校准微球并定期验证仪器的性能。还鼓励定制抗体方案，以及使用FMO对照进行验证。作者提醒不要在实验中未经验证就直接使用已发表的方案，并强调借鉴方案时务必确保试剂供应商的一致性，以尽量减少变异。
- 解混时，强烈建议使用细胞而不是微球作为光谱解混合的单色对照，还需考虑背景细胞自发荧光。如下图所示细胞自发荧光会产生一个小峰，在 YG4-561 通道中可见，根据作者经验，使用补偿微球进行光谱解混合时，将遗漏该“寄生虫”峰。


关于SFC未来要解决的问题，作者提了以下几个：
- 光谱分选仪的实时数据匹配
- 当前荧光微球用于光谱解混的局限性，是否能解决？
- 建议将抗体组合存储到公开可用的储存库中，以增强 SFC 研究中的严谨性和可重复性。
- 希望制造商改进仪器校准，开发出更好的荧光微球用于光谱解混合。
- 期望随着更多的训练数据集可用，开发机器学习和计算方法来支持 SFC 分析。


参考文献：Sharma S, Boyer J, Teyton L. A practitioner's view of spectral flow cytometry [published online ahead of print, 2023 Oct 4]. Nat Methods. 2023;10.1038/s41592-023-02042-3. doi:10.1038/s41592-023-02042-3
s41592-023-02042-3.pdf (1.34 MB, 下载次数: 5, 售价: 1 流星)

2023-10-19 08:21 上传

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