植物流式细胞术数据采集和原始数据分析的最佳实践，做其它物种细胞周期也看看

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Koutecký P等人在2023年10月8日的Cytometry A杂志上介绍了植物流式细胞术（FCM）中的仪器校准和质量控制、仪器和采集设置、原始数据分析方法（门控和直方图建模）以及最佳实践建议。这些设置和方法对于获得可靠的估计和重复性的测量结果至关重要。建议在测量前确定这些设置，以确定数据的数量和质量，并影响所有下游分析。

仪器校准和质量控制
标准的生物医学流式细胞仪可用于植物学研究，但专门为植物样本优化的仪器可能会提供更好的结果。目前已有专门为特定生物和组织设计的仪器，例如用于浮游植物采样的船载仪器，用于采样空气中的花粉和真菌的仪器，以及可以优化脆弱样本的仪器。

植物流式细胞术需要适合荧光染料和应用的光源和光学仪器，常用的荧光染料有PI和DAPI。PI染色样本最好使用绿色固态激光器（532nm）进行分析，DAPI染色样本则主要通过汞弧灯的紫外波段激发。新型仪器也可以使用紫外LED或紫外激光器进行激发。

使用校准微球或已知特性的标准化生物材料定期监测细胞仪的性能，确保其处于最佳状态。这有助于保持测量的准确性和结果的可重复性。

在植物细胞测量中，基因组大小和衍生参数（如倍性水平）的测量需要保证测量的荧光强度与实际荧光强度成正比，因为颗粒的荧光预计与其DNA含量成正比。如果DNA含量与荧光强度之间没有线性关系，则是样品制备（核分离和染色）的问题，而如果实际荧光强度与测量荧光强度之间没有线性关系，则是仪器线性问题。不同厂商的仪器在响应线性性方面存在差异，用户应该了解其仪器的性能。

流式细胞仪的质量控制测试包括峰值CV、线性度和流体力学和光学校准度的测试。建议使用校准微球来检查这三个特征。为保证精确测量，应使用有限的荧光强度范围，这种线性限制意味着需要使用一系列标准来覆盖植物DNA含量的广泛范围。

如认为校准微球的成本较高，可以使用固定细胞（如鸡或鳟鱼红细胞）或植物标准品作为替代品。

建议每天进行质量控制检查。如果检查失败，仪器制造商会提供适当的解决方案。通常，峰值CV问题可以通过清洁或引导（流体问题）或激光对准（光学）来解决。在荧光强度范围内的线性问题可能表明光电探测器存在问题，可能需要维修。

仪器设置
激光仪器除了荧光外，还有两个散射参数可用。前向散射（FSC）反映信号大小，但对于植物细胞核来说不太有用。侧向散射（SSC）反映信号形状和内部结构，对于区分完整和受损细胞核、荧光碎片等颗粒很有帮助。选择新仪器或光源时，SSC参数的可用性可能是重要因素之一。

流式细胞仪中的时间参数非常重要，它可以显示参数随时间的变化。稳定的荧光信号对于确保测量结果的准确性至关重要。如果荧光信号有波动，可能需要清洗和重新校准仪器。如果样品染色时间不足，可能会导致荧光信号在前几分钟内略有增加，直到染色饱和并稳定下来。这可能会导致左偏的荧光峰和较大的变异系数，可能被错误地归因于其他原因。荧光与时间的关系可以通过绘制荧光-时间散点图来检测样品的荧光是否随时间降低，以及是否存在其他技术问题，如激光过热或其他激光故障。

样品流速越慢，核心流的直径就会随着样品流速的平方根而增加，因此为了获得高精度，应尽可能降低样品流速。但是，过慢的流速可能会导致样本的细胞状态恶化、测量时间过长、长时间过后信号获取不稳定或干扰层流等问题。因此，需要在精度和采集时间之间找到平衡点。设置流速以分析每秒几十个信号，通常可以在几分钟内测量数千个细胞核，这样的话，研究人员在工作日内分析数十到数百个样品。

采集设置
直线和对数刻度下的直方图外观有很大的不同。在直线刻度上，峰值的位置直接反映了峰值的平均值，即四倍体峰值的位置比二倍体峰值的位置要远两倍，八倍体峰值的位置比四倍体峰值的位置要远两倍。相比之下，在对数刻度上，峰值平均值的每次加倍都表示为x轴上相同的视觉增量。因此，二倍体和四倍体峰值之间的距离与四倍体和八倍体峰值之间的距离相同。刻度还会影响峰值的形状。在对数刻度上绘制时，具有相同事件数和相同变异系数的二倍体、四倍体和八倍体峰值将具有相同的高度和宽度。如下图，分别用线性（A）和对数（B）模拟荧光直方图，每个峰值反映了从正态分布中随机抽取的 1000 个颗粒，正态分布的 CV = 2.0%，平均值分别为 50、100、200、400 和 800（即随后的平均值相差两倍，类似于内多倍体样本中 DNA 含量为 2C、4C、8C 等的细胞核）。在线性刻度上，右侧的峰值更宽更低。在对数刻度上，峰的高度与颗粒数成正比，峰的外观相同。

建议使用线性标度进行基因组大小/倍性水平分析。使用有限的荧光范围以确保线性。

使用线性和对数刻度各有优缺点，数据在两种刻度之间转换时存在限制。线性刻度可能无法记录低于阈值的低荧光强度或高于刻度的高强度。对数刻度在低强度时每个通道跨越多个通道，而在高强度时则相反。在转换时，无法恢复“缺失”的数据。使用对数刻度时，峰值可以重新计算，但无法正确计算标准差和峰值变异系数。使用线性刻度进行基因组大小测量和倍性估计。使用对数刻度仅限于散射参数和荧光强度。新型仪器可以使用任何刻度，因为所有计算都在线性刻度上进行。

细胞核数量
荧光强度测量存在误差，通常被建模为正态分布，由均值和标准差确定。随着信号数量的增加，峰值均值位置会因为抽样误差而变化，但逐渐接近真实值。我们通常关注样本均值与标准差的比率，因此需要测量足够多的信号以最小化误差。直方图中包含的不仅是我们最感兴趣的G0/G1核，还有其他信号，因此需要更多的事件数。

Jan Suda等人通过实验估算了流式细胞术所需的事件数，发现在获取20000个事件后，与最终值的平均差异在3000个事件后降至0.2%以下，在7000个事件后降至0.1%以下。建议在分析两个峰值时至少进行5000个事件的计数，每个峰值至少分析1000个细胞核。但实际上，作者在单个重复实验的采集过程中发现，较低的数量也足以获得高质量的直方图，建议可以采用放松的指导方针，即总共2000个事件和每个峰600个事件，而不会明显损失精度。

阈值
为了正确可视化要获取的数据，必须设置一个参数作为Discriminator（即主触发器）。只有值高于最小或低于最大阈值的信号才会被记录，而其他信号则被视为“不可见”。流式细胞仪的检测能力非常高，如果没有主触发器，低荧光信号（如自荧光碎片）的背景噪声将构成大部分数据。在基因组大小研究中，荧光通常用于触发，低荧光信号会被丢弃。但是，应该谨慎选择。

首先，应该在最低荧光（最左侧）峰之前留下至少几个“空”（即仅包含碎片）通道，以便触发不会影响峰值均值和CV的计算。其次，当使用未知的材料时，应该将限制设置为显示假定最左侧样本峰的荧光的一半，以免忽略最左侧的峰。

峰的位置和通道数量
由于植物基因组大小巨大，需要使用多种不同的标准来调整峰的位置。这是通过不同制造商的电压或增益参数来完成的。为了数据可比性，在一个实验中需要使用相同的设置。通常使用256-1024个通道进行直方图分析，通道数越多分辨率越高，但通道数越少有利于直方图的统计分析。

对于基因组大小测量和倍性水平分析，应使用线性刻度，并通过调整电压/增益将标准峰定位在x轴左端的1/5处。这个设置和标准峰的大致位置应在实验中对所有样本保持一致。标准峰的出现提供了运行条件稳定的视觉确认，如果峰位于非常不同的位置，这是不可能的。我们预计标准峰在样本之间是相似的，而测试样本的质量可能会有所不同。如果测试样本的基因组大小远低于标准样本，可以将标准峰的峰位定位在较高的通道（例如，靠近直方图的中点），以保持最低预期样本峰位距离左边缘约1/5的位置，只要在整个研究过程中保持不变。

应避免在x轴的最低约10%（例如，在1024通道刻度上低于100）的峰位。首先，低峰位处的一些事件可能会丢失（它们可能会被阈值截断，参见上文），其次，低均值峰的夸张高而窄的形状可能使其难以与均值较高的峰（看起来更宽且必须由更多事件组成才能获得类似高度）进行比较。

原始数据分析方法
原始数据分析主要考虑两种方法：设门和直方图建模。

设门包括根据主观评估手动选择事件，设门有助于排除碎片、粘连等干扰信号，得到纯粹的倍体峰，下图是花粉样本中分析2倍体细胞核的多步设门示例。(A) 在 FL2-H（585 nm）与 FL3-H（670 nm）散点图上选择核区，用于设门剔除碎片。(B) 同一样本在设门之前的 FL2-A 与 SSC 散点图。(C)和(D)显示与(A)设门后相同的数据，(C)手动或(D)使用自动聚类识别工具（"Snap-to "区域，CellQuest Pro，BD Biosciences）在2倍体细胞核周围绘制区域。(E)通过(A)和(C)中的组合设门选择的 2C 细胞核数据，显示在高度与面积关系图上，用于脉冲分析（去除粘连体）。矩形区域仅包含单个细胞核。(F) 未设门数据的直方图，白色的小峰值轮廓显示感兴趣的事件，即单个 2C 核，可见未设门的时候它只是 2C 峰形的一部分，充分说明了前面多步级联设门的重要性。


直方图建模则是利用统计模型进行分析。与手动分析倍体相比，基于模型的方法能提供更客观、可重复的参数估计，在某些情况下还能提供更精确的参数估计。不过，对于噪声特别大的样本来说，如果未经前述设门纯化而直接采用这种方法可能具有挑战性，故必要的时候还是需要先设门再建模。最后但并非最不重要的一点是，由于某些步骤的自动化，建模方法可能比人工设门更快。

一旦确定了必要的模型成分，模型与数据的拟合就是一个常规的统计过程（非线性最小二乘回归）。可使用 flowPloidy、FlowJo或 ModFit等模型拟合软件，模型拟合过程由程序完成，研究人员无需亲自进行统计计算。在建模中，简化奇偶校验统计量（RCS）可用于显示模型对特定样本数据的拟合程度，并有助于进行模型选择。不过，它并不是一种统计检验，只是一种解释指南。一般来说，**RCS 值在 0.7-4.0** 预期范围内的直方图模型是可以接受的。应检查 RCS 值较高的直方图（表示拟合度较差），以确保模型能合理地反映数据，以及是否可以通过调整参数（如使用哪种碎片模型和线性约束）来改进模型。然而，高 RCS 值本身并不会使原本合理的分析失效。尤其重要的是，不要将 RCS 统计量误解为对 DNA 含量（一般为峰值位置或峰值指数）估算准确性的衡量。它只是估计模型与数据的拟合程度，并不能揭示这些数据的质量。DNA 含量估计的质量评估仍应基于前面讨论的参数（CV、核数量）。

结论和最佳做法建议
- 保持仪器处于最佳状态（流体、光学校准），每天使用校准微球或已知特性的标准化生物材料（固定的鸡或鳟鱼红细胞、质量上乘的植物标准，如 P.sativum）监测其性能。
- 除荧光外，还应记录时间参数（用于监测运行过程中的荧光稳定性）和 SSC（如有）（用于区分完整细胞核与受损细胞核、荧光碎片等）。如果打算根据峰面积、峰高和峰宽的组合进行双峰区分（即脉冲分析），则应确保记录相应的参数。
- 使用线性荧光刻度，尤其是在进行基因组大小/倍性水平分析时。使用有限的荧光范围以确保线性。使用校准微球或其他已知特性的材料（如鸡和鳟鱼红细胞）或G2期明显的植物，检查流式机器在所选范围内的线性响应；使用显示多个峰值的多倍体植物来监测线性是一个有争议的问题，不建议使用。
- 对于含有两个主要峰（即一个样本和一个标准样本）和中低碎片水平的样本基因组大小测量，每个峰至少采集 600 个细胞核和/或总共采集 2000 个事件。如果需要非常高的精度，或者为了与文献中的旧建议保持一致，则应采集每个峰 1000 个核或 5000 个事件。对于噪音特别大的样本或存在多个峰值的样本（如高度内多倍体物种），应增加事件总数（尤其是在使用事件总数定义运行时间时），以确保记录到足够多的相关峰值事件。
- 使用阈值剔除低荧光碎片，特别是在使用事件总数来定义运行时间的情况下。不过，在最左边的峰值之前，一定要至少保留几个 "空"（即只包含碎片）通道，以便进行准确的峰值检测和碎片建模。
- 实验过程中应固定标准峰在荧光轴上的大致位置，以便对不同样品进行直观比较。
- 任何峰值都不应位于荧光轴的最低 10% 处（使用线性刻度）。左侧边缘的峰总是显得又高又窄，这可能会掩盖其相对较高的 CV 和/或相对较低的核计数，而右侧的峰则不然。
- 考虑使用直方图模型分析原始数据。如果采用人工设门（例如，由于碎片过多或在特殊情况下，如寻找未还原的配子或其他不同倍性水平的细胞），则应在文章中明确说明设门策略，最好辅以图表说明典型的设门位置。

通过遵循这些最佳实践，就能获得可靠、可重复的结果。


参考文献：Koutecký P, Smith T, Loureiro J, Kron P. Best practices for instrument settings and raw data analysis in plant flow cytometry [published online ahead of print, 2023 Oct 8]. Cytometry A. 2023;10.1002/cyto.a.24798. doi:10.1002/cyto.a.24798