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使用流式细胞术跟踪 ER 中的 ATP 水平

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发表于 2023-12-7 14:37:10 | 显示全部楼层 |阅读模式

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科学家们早就知道,内质网 (endoplasmic reticulum,ER) 需要 ATP 形式的大量能量来执行其蛋白质折叠和转运的功能。然而,控制内质网内 ATP 水平的机制尚不十分清楚。

研究细胞能量学的挑战之一是测量特定亚细胞器(如内质网 (ER) 和线粒体)内的 ATP 水平。过去,研究人员必须依靠大量的生化检测,提供整个细胞或群体的平均 ATP 读数,但不能解释细胞器特异性的动力学。

在 eLife 上发表的一项新研究中,Randal Kaufman博士领导的研究人员利用靶向不同细胞器的荧光 ATP 传感器开发了一种新的流式检测方法。通过表达与信号肽融合的 ATP 传感器,将其引导到内质网(ERAT探针)或线粒体(mtAT探针),它们可以独立监测每个细胞器内的实时 ATP 变化。

在流式细胞仪上进行分析时,ATP传感器提供基于荧光共振能量转移 (FRET) 的比率读数。405 nm 处的激发在两个波长处引起荧光发射-一个波长为 445 nm 附近的供体荧光素,一个波长为 530 nm 附近的受体荧光素。两种发射信号的比值直接对应于细胞内 ATP 水平,从而能够快速评估 ER ATP。

下图是在 HeLa 细胞中,siRNA介导的 Slc35b1 敲低减弱了 SERCA 抑制对 ER ATP 水平的Ca2 + 反应性。在细胞成像前,用针对 Slc35b1 的 siRNA 处理表达 ERAT4 报告基因的 HeLa 细胞48 h,通过 qRT-PCR 定量 si-Slc35b1/siRNA 对照 = 9.5±1.4%(平均值±S.E.M.,n = 3个样本/组)。与乱序 siRNA 处理的 HeLa 细胞相比,si-Slc35b1组的基础 ER ATP 水平显著降低(双尾 t 检验p < 0.001)。同时 si-Slc35b1 组加入 BHQ 后 ER ATP 下降减弱。最后用 2-DG(10 mM) 替代葡萄糖 (10 mM) 确保细胞 ATP 耗竭作为另一个对照。加入 2-DG 后,两组未发现差异。
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研究发现氧化磷酸化 (OxPhos) 是内质网的主要 ATP 来源,因为 OxPhos 抑制剂如寡霉素可显著降低内质网ATP。令人惊讶的是,糖酵解抑制剂的作用相反,提高了内质网 ATP 水平。

ERAT 传感器可以非侵入性实时检测完整活细胞内的ATP,为同时定量分析成千上万个单细胞的 ATP 水平提供了一个强大的新工具。

该研究还表明,通过 SERCA 泵建立的内质网膜维持钙梯度,对于稳定的 ATP 转运到细胞器是至关重要的。耗尽内质网钙库的药物,可迅速降低内质网ATP。

通过将基因编码的 ATP 传感器与流式细胞术分析相结合,这项创新工作为细胞如何在一个关键的细胞器——内质网内调节 ATP 水平提供了新的见解,展示了利用前沿成像工具和先进的细胞分析在细胞器水平上解决长期存在的生物学问题的能力。

参考文献:Yong J, Bischof H, Burgstaller S, et al. Mitochondria supply ATP to the ER through a mechanism antagonized by cytosolic Ca2. Elife. 2019;8:e49682. Published 2019 Sep 9. doi:10.7554/eLife.49682


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