关于CD44和CD62L圈门的问题

Detachjo

使用Mojosort磁珠从小鼠脾脏分离出CD3 T细胞
刚分离下来时可以区分出naive T、effector memory T、Central memory T cell

naive（CD62L+、CD44-）Tem(CD62L-、CD44+)、Tcm（CD62L+、CD44+）

然而在体外培养72h后（CD3抗体铺板于底面、1640培养基内加入CD28抗体、IL-2），再去跑流式细胞几乎全都集中于右上象限，细胞分群不明显，请问原因可能出在哪里？
短短体外培养72h，会使T细胞全部分化成Central memory T cell吗？
自我反思问题可能出在：
1.染色细胞数目过多？
2.未进行Fc block？
3.不要直接用PBS去洗细胞？改用FACS buffer去洗？
4.细胞形状大小的问题 FCS SSC与刚分离下来时差距明显
5.培养时间的问题？时间不够长？

实验操作流程

刚分离下来

培养72h后

Detachjo

@niwanmao
请老师有空的时候帮忙解答一下

niwanmao

从图上看，似乎细胞确实存在明显的活化，但分群似乎还是基本正常的，要么你对活化后的样本分别做一下62L和44的单标看看

Detachjo

niwanmao 发表于 2023-12-15 16:58
从图上看，似乎细胞确实存在明显的活化，但分群似乎还是基本正常的，要么你对活化后的样本分别做一下62L和4 ...

感谢老师的回复，我之前对活化样本做过单染的。
但我的疑问在于为什么细胞全都集中在了右上角即中心记忆T细胞的状态，效应T细胞和它之间分群非常不明显，需要怎么做才能使得二者分群分开呢？
问题可能出在哪里呢？

niwanmao

Detachjo 发表于 2023-12-19 12:50
感谢老师的回复，我之前对活化样本做过单染的。
但我的疑问在于为什么细胞全都集中在了右上角即中心记 ...

从这里叠加的单染管看，似乎确实是分不开的

重复过几次呢？

Detachjo

niwanmao 发表于 2023-12-19 13:52
从这里叠加的单染管看，似乎确实是分不开的

重复过几次呢？

重复过很多次了，老师。很让人疑惑的一点就是样品刚从小鼠脾脏分离出来时是能够看出明显分群的，当时在体外添加CD3/CD28/IL-2的1640培养基中培养一天之后去跑流式就能够发现CD44的表达明显升高，从naive状态进入effector或者memory状态时间这么短吗

niwanmao

Detachjo 发表于 2023-12-28 12:13
重复过很多次了，老师。很让人疑惑的一点就是样品刚从小鼠脾脏分离出来时是能够看出明显分群的，当时在体 ...

一般刺激培养后的细胞，通常很容易出现分群差的现象，可能跟自发荧光有关，而且我看到上面图中，刺激后里面中性粒细胞区域也出现一群，很好奇那些究竟是不是T细胞，如果是，大到这个地步，自发荧光可就不得了。

这个目前感觉还没有一个非常好的解决办法，我在想可能是不是核内转录因子可以帮助一下？

Detachjo

niwanmao 发表于 2023-12-28 12:39
一般刺激培养后的细胞，通常很容易出现分群差的现象，可能跟自发荧光有关，而且我看到上面图中，刺激后里 ...

老师，"刺激后里面中性粒细胞区域出现的一群"具体指的是哪一群细胞呢？
另外核内转录因子检测的话，有什么好的指标用来区分效应T、效应记忆T、中枢记忆T细胞这些吗？
看到有些文章里是采用激活后再刺激的方法能够使得分群不明显的细胞出现分化亚群。

tiger

Detachjo 发表于 2023-12-28 14:12
老师，"刺激后里面中性粒细胞区域出现的一群"具体指的是哪一群细胞呢？
另外核内转录因子检测的话，有什 ...

请将FCS文件放上来

Detachjo

tiger 发表于 2023-12-28 17:06
请将FCS文件放上来

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