treg

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老师，第一次做treg，在分析数据的时候出现了CD25-FOXP3+的th cell，不知道这一群细胞和CD25+FOXP3+的Th cell有什么区别（已排除漏加CD25抗体可能）？两者都算是treg，在功能上相似还是其实应该算作两个亚群，在功能上有区别呢？我可以再如何分析或者怎么优化实验么？求大佬解惑

niwanmao

句号 发表于 2024-3-21 19:48
倪老师，图1和图2是圈门逻辑图，th到treg这个门控我把FMO管也放上去做个比较，因为虽然是同一个样本但是在t ...

这几个图看起来还是像真阳的，之前那个担心假阳性，主要是因为SSC小于正常淋巴群体。

不过第1个图上的FSC/SSC，淋巴细胞门圈这么右，确定左边这些信号都是碎片？我的建议是先用普通散点图着色看一下其边界，再决定淋巴细胞门的位置比较合适。

至于CD25的强弱，是有可能跟疾病有关

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标本来源是人的PBMC

niwanmao

1、整个方案是如何搭配？前面的设门逻辑是怎么样的？
2、你这里的荧光通道分别对应哪个标记？

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倪老师，我的整个配色方案是：去死活：FVD780，CD3 prpcy5.5，CD4 BV605,CD25 APC，foxp3 PE，CD152 CTLA-4，还有一个间标配色是AF488,CD3、CD25用的是BL的，CD4、CD152用的是BD的抗体，foxp3和固定破膜套装用的是赛默飞的Invitrogen的，整个染色流程是：去死活-封闭-间标一抗-间标二抗-表染-固定破膜-胞染-上机（间标一抗来源与其他抗体来源一致），在表染的时候因为加样次数太多，我就是预先将抗体混匀后一并加入（把CD3、CD4、CD25抗体吸取到一个EP管混匀后一次加入相应管），圈门逻辑：去黏连-圈淋巴-去死活-圈Th细胞-圈treg-圈CD152+treg。此图展示的荧光图APC代表的是CD25，PE代表的是foxp3，之后我也有试过用单阳逐级圈门，发现foxp3的FMO管和全染管区别很大，全染管看起来foxp3阳性的一群细胞SSA更小，我也不知道该直接通过FMO界定他的阴阳群还是看全染管细胞分群来看，谢谢倪老师解惑！！！！

niwanmao

句号 发表于 2024-3-21 10:05
倪老师，我的整个配色方案是：去死活：FVD780，CD3 prpcy5.5，CD4 BV605,CD25 APC，foxp3 PE，CD152 CTLA-4 ...

结合一下上级门看一下，总体感觉这些信号是假阳

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倪老师，图1和图2是圈门逻辑图，th到treg这个门控我把FMO管也放上去做个比较，因为虽然是同一个样本但是在treg这个门上稍微有一些差异。我在做的时候都是使用了Fc block封闭了30min（BL），所有的抗体都做过抗体滴定计算过SI指数（只是foxp3做出来的阳性不是很高，所以当时也很纠结是否可靠，在赛默飞的技术老师的帮助下确定的抗体适合浓度就是推荐浓度，的确滴定过后foxp3的移动明显减少）。我做了大概100多个样本，treg的形态千奇百怪（图3），主要是发生在疾病组（PNS），在圈门上我也特别的纠结，不知道这个门控该如何去调整（FMO和同型感觉并没有帮助到我圈门，有的组看得到明显的分群但是就感觉稍微foxp3低了一点，不知道该通过FMO去界定他的阴阳分群还是说根据这一群细胞的形态，并且在部分样本出现了CD25-或弱阳性，foxp3+的 一群细胞，主要出现在疾病组，我也很纠结到底这一群细胞是不是treg？和CD25+FOXP3+的treg是否能算同一群还是应该该去分亚型。）因为抗体其实是混匀后一次加入的，同时做的control并没有出现这个问题，只出现在疾病组，排除了CD25漏加的可能性）。在做的时候，我自己觉得做的不是很好的地方就是细胞浓度不统一（血量一致但是疾病组提取出来的PBMC更少），细胞计数计的很不准，之前是准备最后统一分析的时候绛到一个数量级来统计，目前因为数据已经不知道该如何统计了，还没有试过绛到同一个细胞量去分析

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倪老师，我在FSC/SSC这一级圈门的时候一直都不知道怎么去确定门控会更合适，图一是我把这个门在散点图和伪彩图上的一个展示，我也不知道到底如何圈门会更合适一点。之前在样本圈门的时候，我就是出现过CD4+CD3-的一圈细胞（图二），我用backgating功能（图三）回顾过去就是在上右方，所以门控就往右下移动了一些。至于您提到的SSC小于正常淋巴群体这个问题，我也很是困惑，也去找过公司的技术，找到的一个原因就是SSC的电压给的比较小（我们是流式老师上机，我自己也不是很懂这个电压调控），之前我一直很奇怪为啥我的FSC/SSC看起来细胞群特别多，像是提的很不纯，就用同一个样本做了一个表染、permIII以及我的foxp3固定破膜套装做了一个对比图，发现用了这个固定破膜套装在FSC/SSC上呈现出来就不太一样，foxp3固定破膜套装固定过后SSC整体发生了下移，不知道是不是也跟这个破膜剂影响有关（图四）。最后就想再请教倪老师关于foxp3圈门的事情，如果说CD25的强弱跟疾病有关系，那我需要对这两种foxp3进行一个区分么？之前尝试十字门圈门发现foxp3双阳的很多都没被圈到，不规则门可以么（图五）？还是说梯形会更好（图六）？还有就是一直很困扰我的地方，在foxp3阴阳群我该如何去界定呢？有的群就是感觉foxp3阳的不是特别明显，但看起来又是明显的一群，我就很纠结这群细胞算不算treg呀（图七），谢谢倪老师解惑

niwanmao

句号 发表于 2024-3-22 14:01
倪老师，我在FSC/SSC这一级圈门的时候一直都不知道怎么去确定门控会更合适，图一是我把这个门在散点图和伪 ...

不同破膜剂，对FSC改变是不同的

图6和7的设门没问题

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那倪老师，之前用梯形门去圈treg，就是出现了一些样本让我特别的困惑，不知道该如何去界定阴阳群才是对的。大部分样本分群很明显，就算没有对照其实都很容易圈出来，但是有部分样本出现了CD25阳性不足，但是FOXP3阳性挺强的（图1、图2），或者就是CD25挺阳的，foxp3又感觉阳性不足，而且都是明显的聚集成群，通过FMO、等高线图我也不能完全确定门控，非常的困惑到底我的门控标准应该怎么去设置，是完全按照FMO来还是说看细胞聚集的群来看啊？谢谢倪老师的耐心解答！！！