一场纳米世界之旅，揭开细胞外囊泡纯化和PD-L1阳性sEV的秘密

niwanmao

本文素材来源：Kobayashi H, Shiba T, Yoshida T, et al. Precise analysis of single small extracellular vesicles using flow cytometry. Sci Rep. 2024;14(1):7465. Published 2024 Mar 29. doi:10.1038/s41598-024-57974-3IF: 4.6 Q2

在人体这个浩渺无垠的宇宙里，始终在演奏着一场宏大的细胞交流交响乐，编排和指挥者，正是名为细胞外囊泡（EVs）的微小信使。这些纳米级别的使者，如同携带丰富信息的宇宙飞船，装载着蛋白质、核酸以及脂质等多种生命信息分子，在生命的正常运行和疾病的演变过程中扮演着不可或缺的角色。尤其值得关注的是那些直径在30至150纳米之间的小型EVs（sEVs），犹如隐形的纳米勇士，在癌症、神经退行性疾病等多种疾病的诊断与治疗中展现出了巨大潜力，成为科学家们积极探讨的对象。

长久以来，sEVs的高度异质性如同一道迷雾笼罩在科研人员面前，阻碍了我们对其如何诞生及如何运作的深层理解。传统分析手段仿佛是从高空俯瞰繁复的城市天际线，只能捕捉到总体轮廓，却无法触及单个微观实体的细腻变化。流式细胞仪这一高科技工具适时介入，如同一台精密的显微望远镜，帮助我们揭示单个sEV的微观秘密，赋予我们前所未有的清晰视野去洞察纳米世界的奇妙结构。

然而，即便是这样强大的分析仪器，也面临一道巨大的难题——要求样本具备极高的纯度，即不含任何可能干扰分析结果的未结合抗体和其他污染物。这好比是在一片布满陷阱和迷宫般的复杂环境中寻找一条清晰路径。

Hisano Kobayashi等人发起了一番探索，致力于优化sEV的纯化技术，为精准的单颗粒分析扫清障碍。他们的实验揭示，尽管经典的超速离心法对于sEV颇为有效，但无法消除染色时未结合的抗体干扰。通过流式和原子力显微镜(AFM)均可发现蛋白质聚集体和抗体残迹。

面对困境，研究团队并未止步，而是积极探寻其他纯化策略，包括尺寸排阻色谱法（SEC）和崭新的TIM4亲和分离技术。这些新方法最终被证实为卓越有效的解决方案，能够极其精确地将纯净的sEV从混杂的杂质中剥离出来。AFM也证实了经过优化处理后的sEV样本，彻底不见了先前方法遗留下来的混乱聚合物。

流式图：


原子力显微镜图（图中短实线为外泌体，长虚线为背景）：



借助这些优化的纯化技术，研究者得以潜入sEV生物发生的深渊和异质性的迷宫。通过对缺乏ALIX、HGS和TSG101等关键生物生成途径成分的细胞产生的sEV进行细致剖析，发现，缺失ALIX会导致CD63+ sEV的数量显著下降，但不影响CD9+ 或 CD81+ sEV的水平，这表明ALIX参与了通过syntenin-syndecan途径生成CD63+ sEV的过程。而HGS的缺失则降低了CD63+/CD81+ 和 CD9+/CD63+ sEV的数量，提示HGS在多个途径中起作用，不仅限于syntenin-syndecan途径，可能影响更广泛的sEV亚群生成。TSG101的耗竭则影响了多种sEV亚群的产量，说明ESCRT途径在内的多种生物发生通路在其中发挥着重要作用。

Hisano等人进一步深入癌症免疫疗法领域，探索表达 PD-L1 的 sEV 这一难以捉摸的群体，PD-L1 是免疫检查点通路中的一个关键角色。通过评估人类头颈部鳞状细胞癌的三种不同细胞系和 293T 细胞（非癌细胞）的细胞 PD-L1 和 sEV PD-L1 表达，发现在非肿瘤细胞293T中，细胞 PD-L1 的表达量和 PD-L1+ sEV 的阳性率都很低。在 OSC-20 细胞中也观察到了类似的结果。用 IFN-γ 刺激的 HOC313 细胞表达了高水平的细胞 PD-L1，而 PD-L1+ sEV 的数量仍很少，细胞和sEV之间的PD-L1表达量无相关性。而用 IFN-γ 刺激的 OSC-19 细胞，细胞PD-L1 的表达量和sEVs PD-L1表达量成正比，从2.0%增加到4.7%。这些结果表明，有些肿瘤类型 细胞PD-L1的表达水平与 PD-L1+ sEVs之间没有相关性。



这一发现暗示可能存在一种专门的分拣机制，负责将 PD-L1 有选择性地整合到 sEVs 亚群中。可能为靶向免疫疗法的开发提供指导。

随着这场纳米尺度探险之旅的推进，研究者们的每一次努力都如同在科学画卷上绘下璀璨的一笔，不仅深化了我们对人体纳米通讯机制的理解，更开启了通往尚未揭示的生命现象的大门。优化的纯化技术和单颗粒分析的运用，为探究sEV的生物生成机理、异质性特征以及它们在疾病进程中的具体功能搭建了坚实的理论基石。


要点
1. 细胞外囊泡 (EVs)，尤其是小型 EVs (sEVs)，在生理过程和疾病进展中起着至关重要的作用，但由于分析方法的局限性，sEVs异质性一直是个挑战。
2. 传统的超速离心法不足以去除用于染色 sEVs 的未结合抗体，导致流式分析不准确。
3. 高纯度的 sEV 分离方法，如尺寸排阻色谱法（SEC）和 TIM4 亲和分离法，能有效地将 sEV 与未结合的抗体分离，从而进行准确的单颗粒分析。
4. 利用优化的分析方法，深入研究 sEV 的生物发生途径，发现 ALIX 参与了 syntenin-syndecan 途径，HGS 参与了多个途径，TSG101 参与了 ESCRT 途径。
5. PD-L1 是癌症免疫疗法中的一个关键角色，研究发现有些肿瘤类型 细胞PD-L1的表达水平与 PD-L1+ sEVs之间没有相关性，表明 PD-L1 进入 sEV 存在一种专门的分拣机制。
6. 优化的纯化方法和单颗粒分析技术为深入了解 sEV 的生物发生、异质性及其在疾病过程中的作用奠定了基础。