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大鼠全血刺激实验,什么刺激剂对于检测什么胞内细胞因子效果最好?

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发表于 2024-4-25 14:29:26 | 显示全部楼层 |阅读模式

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全血刺激实验
实验目的
- 评估不同浓度的刺激性试剂对大鼠全血中细胞因子产生的影响。

实验步骤
1. 血液采集
  • 从健康或经免疫抑制剂处理的SD大鼠采集外周静脉血。
  • 使用含有干燥肝素的真空管收集血液。

2. 制备刺激溶液
  • 将PHA、LPS、Con A、PWM、PMA/ionomycin等刺激试剂用PBS稀释,并储存在-4°C。

3. 全血与刺激试剂混合
  • 将肝素化全血200 μL加入96孔板中。
  • 添加不同浓度的刺激试剂(PMA: 1, 5, 和 25 ng/mL; Ionomycin: 1 μg/mL; PHA, LPS, Con A, PWM: 1, 5, 和 10 μg/mL)。

4. 孵育条件
  • 将加有刺激试剂的全血在37°C、5% CO2条件下孵育。
  • 设定不同的孵育时间点:0, 2, 4, 6, 8 或 10小时。

5. 孵育后处理
  • 孵育结束后,将血液样本在离心机中离心,以收集上清液。
  • 将上清液转移到-80°C的冰箱中保存,以备后续细胞因子的检测。

6. 细胞活性评估
  • 使用流式细胞术对经过PMA/ionomycin处理6小时后的免疫细胞进行活性测试。

7. 细胞因子检测
  • 使用相应的检测试剂盒,对上清液中的细胞因子进行多重检测。

8. 数据分析
  • 使用SPSS软件进行数据分析,比较不同组别之间的细胞因子水平。


注意事项
- 确保所有操作在无菌条件下进行,以避免污染。
- 严格按照试剂盒和设备的操作手册进行实验,以确保数据的准确性和可重复性。
- 考虑到细胞因子的半衰期较短,应在孵育后尽快进行细胞因子的检测。


实验结果
刺激剂对细胞因子产生的影响
1. PMA/ionomycin组合
  • IL-2, IFN-γ, TNF-α, TGF-β, RANTES:25 ng/mL PMA和1 μg/mL ionomycin联合刺激6小时内显著增加这些细胞因子的产生。

2. PHA
  • IL-2, RANTES, TGF-β:在8小时后刺激可增加这些细胞因子的产生。
  • IL-4, IL-6:较弱地增加这些细胞因子的水平。

3. PWM
  • IFN-γ, RANTES, TGF-β:1 μg/mL PWM在6小时后显著增加这些细胞因子的产生。

4. LPS
  • TNF-α, RANTES, IL-10:在2到6小时内显著增加这些细胞因子的产生,并对IL-2产生较弱的促进作用。

5. Con A
  • RANTES:显著增加RANTES的水平,但对其他细胞因子的影响较小。


统计图表
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结果解释
- PMA/ionomycin:作为最优的刺激剂组合,因其能在较短的时间内以较低的剂量显著增加多种细胞因子的产生。
- PHA和PWM:虽然也能增加特定细胞因子的产生,但效果不如PMA/ionomycin组合显著或需要更长的孵育时间。
- LPS:主要增加了炎症相关的细胞因子,如TNF-α和IL-10。
- Con A:对细胞因子产生的影响有限,主要增加了RANTES。


参考文献:Ai W, Li H, Song N, Li L, Chen H. Optimal method to stimulate cytokine production and its use in immunotoxicity assessment. Int J Environ Res Public Health. 2013;10(9):3834-3842. Published 2013 Aug 27. doi:10.3390/ijerph10093834
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