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[结构和原理] CCR2没有表达?

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发表于 2024-6-9 22:12:49 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
测的心脏免疫细胞,文献中提到心脏有炎症后会有很多CCR2+ monocytes。
我发现虽然实验组中Ly6chi monocytes很多,但是CCR2+细胞群几乎没有。和文献不一致
另外一个课题里我也取了小鼠皮下肿瘤做流式,同样Ly6chi monocytes很多,CCR2+细胞群几乎没有。
现在不知道是操作有问题,还是本身确实就没有,不知道该从什么方向分析。

心脏样本

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发表于 2024-6-10 14:03:08 | 显示全部楼层
首先,确认模型是否可靠;
其次,确认抗体性能是否可靠,小鼠骨髓中单核细胞可能相对比较好染一点,试试看,如果仍染不出,可联系厂家技术支持确认是否换克隆号或换荧光素
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 楼主| 发表于 2024-6-10 16:35:08 | 显示全部楼层
本帖最后由 瓜瓜999 于 2024-6-10 18:47 编辑
niwanmao 发表于 2024-6-10 14:03
首先,确认模型是否可靠;
其次,确认抗体性能是否可靠,小鼠骨髓中单核细胞可能相对比较好染一点,试试看 ...

谢谢老师建议。
组里其他人也是相同模型,但是mouse strain不一样,有CCR2+细胞,但数量不太多。
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发表于 2024-6-10 22:49:28 | 显示全部楼层
我建议先在CD45或者CD11b里面圈门,再看CCR2,如果这样都没有CCR2阳性群体,那就大概率你的染色或者抗体出了问题,如果只是LY6C高表达的没有,则有可能是单核细胞和CCR2表达时间不同导致的
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发表于 2024-6-11 11:58:40 | 显示全部楼层
本帖最后由 Fusca 于 2024-6-11 11:59 编辑

CCR2染不出来很多情况下都是因为抗体不行和强度不够。小鼠的CCR2抗体最推荐用R&D的,但是要注意效期,此外根据组织类型去做抗体滴定也很重要,R&D的抗体过期了确实也会染不出。其次可以选择BD或eBioscience的。推荐的克隆号可以看文献。另外就是CCR2表达还是比较弱的,推荐用PE和APC。千万不要用B家的,用CCR2 ko小鼠试过了,不该表达的有很强的非特异性表达该表达的细胞倒是啥也染不上
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 楼主| 发表于 2024-6-11 16:24:11 | 显示全部楼层
Fusca 发表于 2024-6-11 11:58
CCR2染不出来很多情况下都是因为抗体不行和强度不够。小鼠的CCR2抗体最推荐用R&D的,但是要注意效期,此外 ...

非常感谢。请问你说的B家是指biolegend吗,我们用的就是biolegend的>︿<,没有用APC PE,选的BV
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 楼主| 发表于 2024-6-11 16:46:45 | 显示全部楼层
麦小光 发表于 2024-6-10 22:49
我建议先在CD45或者CD11b里面圈门,再看CCR2,如果这样都没有CCR2阳性群体,那就大概率你的染色或者抗体出 ...

CD45和CD11b里都没有(T_T)
有篇文章(bioRxiv),用的相同模型,他们做的single-cell seq,发现有 Ccr2+/Ly6c+ monocyte cluster。
我染的其他marker都还算可以,但是CCR2一点也没有,所以我在想是不是抗体的问题

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发表于 2024-6-11 21:11:11 | 显示全部楼层
本帖最后由 Fusca 于 2024-6-11 21:15 编辑
瓜瓜999 发表于 2024-6-11 16:24
非常感谢。请问你说的B家是指biolegend吗,我们用的就是biolegend的>︿<,没有用APC PE,选的BV ...

对的,因为我们要分选CCR2+/-单核,专门测试过各家的抗体,这家的真的染不出来单核,我推荐的那几个起码我们做血和骨髓是可以染到正确的群。另外BV的话你用的这个V810太弱了,如果一定要用用V/UV的话可以考虑BV421/BUV395,不局限的话更推荐PE/APC。CCR2的表达不是很强,想要好看的分群一定要强荧光素+滴定。

一个测试CCR2抗体比较好的方法是取小鼠的血作为阳性对照,染CD11b、Ly6C、Ly6G和CCR2, CD11b+Ly6G-Ly6C+的细胞里有30%-50%是CCR2阳性的,且分群较好。可以利用这个已知的数据去看这个抗体是不是真的坏了。

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发表于 2024-6-12 12:52:22 | 显示全部楼层
Fusca 发表于 2024-6-11 21:11
对的,因为我们要分选CCR2+/-单核,专门测试过各家的抗体,这家的真的染不出来单核,我推荐的那几个起码我 ...

对的,中低表达的蛋白,配合低效价的抗体,再整上低亮度的荧光素,基本上就是一个大写的GG
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发表于 2024-6-12 13:04:06 | 显示全部楼层
瓜瓜999 发表于 2024-6-11 16:46
CD45和CD11b里都没有(T_T)
有篇文章(bioRxiv),用的相同模型,他们做的single-cell seq,发现有 Ccr2+/Ly ...

对的,中低表达的蛋白,配合低效价的抗体,再整上低亮度的荧光素,基本上就是一个大写的GG,流式配色不能瞎配,强蛋白配合中低荧光,弱蛋白配合强荧光,这样才会高效又经济。Biolegend的东西得去试,属于高性价比的东西,虽然是进口牌子,但是质控不怎么严格,反而我最近试了一些国产的都比他家强,什么联科,四正柏之类的。
可以参考之前倪老师的帖子:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-7895-1-1.html
还有就是流式荧光素强弱排名:
https://flowcyto.cn/bbs/forum.ph ... amp;_dsign=03b1fcf1
Mair F, Tyznik AJ. High-Dimensional Immunophenotyping with Fluorescence-Based Cytometry: A Practical Guidebook. Methods Mol Biol. 2019;2032:1-29.
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