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[归档] 流式分选显示细胞30万,重悬后计数只有10万,正常吗

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发表于 2024-6-17 17:07:59 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
流式分选收集管细胞总和应该有30万,200ul重悬后计数只有10万,细胞活率只有50%甚至不到,正常吗?有什么办法提高分选得率呢。

目前我的操作是每半个小时用培养基润洗收集管管壁。

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发表于 2024-6-17 21:35:32 | 显示全部楼层
以下方法供参考:
1.在分选过程中,推荐使用含血清的、基于PBS或HEPES缓冲液的培养基。
2.将分选后的细胞置于冰上,以防止分选过程中细胞死亡。
3.在分选过程中使用类似DAPI的活力染料来排除死细胞并仅收集活事件。
4.如果分选目标群体占原细胞群的 10%至 99%,则应使用 15 毫升锥形离心管。离心管中应装入 5 毫升分选收集培养基(见第1条)。如果分选目标群少于原群体的 10%,则应在 15 毫升收集管中加入 10-13 毫升培养基,或在 流式管中加入数毫升培养基。如果在 96 孔板中分选,应在分选前在每个孔中放入 100-200 ul(建议 200 ul)培养基。
5.优化喷嘴尺寸(至少为细胞直径的5倍)和压力,以最大限度地减少单元上的剪切应力。
你所说的每30分钟培养基冲洗一次是一种很好的做法,但结合上述其他方法有助于提高产量和活细胞数量。

参考:
1.https://www.biotech.cornell.edu/ ... lity%2020200421.pdf
2.https://www.ucl.ac.uk/child-heal ... ice-guidelines/cell
3.https://flowcytometry.medicine.u ... preparation-sorting
4.https://www.linkedin.com/pulse/3 ... orting-tim-bushnell
5.https://med.virginia.edu/flow-cy ... s-for-cell-sorting/
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发表于 2024-6-18 09:48:12 | 显示全部楼层
偏差这么大的话,建议楼主首先确认一下仪器质控、液滴延迟和液流位置设置等。正常的流式分选,细胞应该会打到收集管的液面中央位置,收集管管壁上不会有特别多液滴。如果这些没有问题的话,再按照倪老师的方法提高细胞活率。
我因为没有受过正规的流式分选培训,但做分选还是积累了一些经验,可能不正规,楼主按需采纳:
流式的细胞分选是一个相对复杂的实验,需要团队合作,最好是有人负责细胞前处理,有人负责流式细胞仪的调试和分选,有人负责分选后细胞的处理。这样分工合作,可以有效缩短细胞处于不利环境的时间;
对于待分选的细胞,用含2% FBS的PBS重悬,并放置于冰上;上样时采取少量多次的方法,单管样品分选不超过30 min;
对于分选后的细胞,我们是直接用放有纯血清的接收管进行收集,并确保接收管中细胞悬浮液的FBS浓度不低于20%,接收管的更换与样品管同步;
分选后得到的细胞,接收管换下来后就立刻进行处理或者回测,没问题的话,直接处理后放回培养箱培养;
重要的是,从消化细胞经染色、分选再到将细胞放回培养箱,整个过程中细胞绝大部分时间处于4度,整个过程不要超过8h。

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发表于 2024-6-26 17:26:00 | 显示全部楼层
可以提前用BSA coat一下收集管,能减少一些损失。
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发表于 2024-7-4 16:01:06 | 显示全部楼层
有几个问题我觉得你可以注意一下
1、管子是否用FBS包被过,非常建议收集管和后续收集的离心管都至少用2ml FBS包被过夜使用。把管子上每个角落都用FBS润一遍之后相对会比较好。这是因为分选下来的细胞都是带电荷的,静电吸附作用非常强,会造成一部分损失。
2、你的细胞活率不高,这个也是一个问题,可以从几个方面排查入手,第一,你的样本制备过程是不是可以保持更温和低温的方式?提高上机前的活细胞比率。第二,你有没有加死活染料,如dapi,7-aad,fvs等,排除死细胞之后能够提高你分选下来的活细胞比例。第三,你的细胞是不是脆皮细胞?比如粒细胞。本身时间就短。那就需要注意无菌处理,适当的抗生素,缓冲液体系里面多加点BSA或者FBS,收集管中多加点含血清的培养基,一个是防止细胞被砸死,一个是血清和培养基被液滴过度稀释。第三,及时收集你的细胞,尤其是你的分选仓没有低温控温能力的时候。如果有就打开这个功能。及时收集到冰上,并且补充上培养基。

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发表于 2024-7-5 15:23:57 | 显示全部楼层
分选得到的细胞数与仪器显示的不符,还有可能是分选接收的细胞进行离心时损失较大。之前分选过脾淋巴细胞亚群,在15ml离心管中总体积较大(比如10ml或更多),离心力或时间不够,导致有的细胞离不下来,加大离心力后发现回收的细胞明显增加,但可能会损伤细胞。所以,分选后离心时离心管中的细胞悬液体积不宜过大,尽量减少细胞损失,使实际计数与仪器显示更接近。
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