流式分选显示细胞30万，重悬后计数只有10万，正常吗

小王观战

流式分选收集管细胞总和应该有30万，200ul重悬后计数只有10万，细胞活率只有50%甚至不到，正常吗？有什么办法提高分选得率呢。

目前我的操作是每半个小时用培养基润洗收集管管壁。

niwanmao

以下方法供参考：
1.在分选过程中，推荐使用含血清的、基于PBS或HEPES缓冲液的培养基。
2.将分选后的细胞置于冰上，以防止分选过程中细胞死亡。
3.在分选过程中使用类似DAPI的活力染料来排除死细胞并仅收集活事件。
4.如果分选目标群体占原细胞群的 10%至 99%，则应使用 15 毫升锥形离心管。离心管中应装入 5 毫升分选收集培养基（见第1条）。如果分选目标群少于原群体的 10%，则应在 15 毫升收集管中加入 10-13 毫升培养基，或在 流式管中加入数毫升培养基。如果在 96 孔板中分选，应在分选前在每个孔中放入 100-200 ul（建议 200 ul）培养基。
5.优化喷嘴尺寸（至少为细胞直径的5倍）和压力，以最大限度地减少单元上的剪切应力。
你所说的每30分钟培养基冲洗一次是一种很好的做法，但结合上述其他方法有助于提高产量和活细胞数量。

参考：
1.https://www.biotech.cornell.edu/ ... lity%2020200421.pdf
2.https://www.ucl.ac.uk/child-heal ... ice-guidelines/cell
3.https://flowcytometry.medicine.u ... preparation-sorting
4.https://www.linkedin.com/pulse/3 ... orting-tim-bushnell
5.https://med.virginia.edu/flow-cy ... s-for-cell-sorting/

wxd

偏差这么大的话，建议楼主首先确认一下仪器质控、液滴延迟和液流位置设置等。正常的流式分选，细胞应该会打到收集管的液面中央位置，收集管管壁上不会有特别多液滴。如果这些没有问题的话，再按照倪老师的方法提高细胞活率。
我因为没有受过正规的流式分选培训，但做分选还是积累了一些经验，可能不正规，楼主按需采纳：
流式的细胞分选是一个相对复杂的实验，需要团队合作，最好是有人负责细胞前处理，有人负责流式细胞仪的调试和分选，有人负责分选后细胞的处理。这样分工合作，可以有效缩短细胞处于不利环境的时间；
对于待分选的细胞，用含2% FBS的PBS重悬，并放置于冰上；上样时采取少量多次的方法，单管样品分选不超过30 min；
对于分选后的细胞，我们是直接用放有纯血清的接收管进行收集，并确保接收管中细胞悬浮液的FBS浓度不低于20%，接收管的更换与样品管同步；
分选后得到的细胞，接收管换下来后就立刻进行处理或者回测，没问题的话，直接处理后放回培养箱培养；
重要的是，从消化细胞经染色、分选再到将细胞放回培养箱，整个过程中细胞绝大部分时间处于4度，整个过程不要超过8h。

myy559

可以提前用BSA coat一下收集管，能减少一些损失。

CPUSnape

有几个问题我觉得你可以注意一下
1、管子是否用FBS包被过，非常建议收集管和后续收集的离心管都至少用2ml FBS包被过夜使用。把管子上每个角落都用FBS润一遍之后相对会比较好。这是因为分选下来的细胞都是带电荷的，静电吸附作用非常强，会造成一部分损失。
2、你的细胞活率不高，这个也是一个问题，可以从几个方面排查入手，第一，你的样本制备过程是不是可以保持更温和低温的方式？提高上机前的活细胞比率。第二，你有没有加死活染料，如dapi，7-aad，fvs等，排除死细胞之后能够提高你分选下来的活细胞比例。第三，你的细胞是不是脆皮细胞？比如粒细胞。本身时间就短。那就需要注意无菌处理，适当的抗生素，缓冲液体系里面多加点BSA或者FBS，收集管中多加点含血清的培养基，一个是防止细胞被砸死，一个是血清和培养基被液滴过度稀释。第三，及时收集你的细胞，尤其是你的分选仓没有低温控温能力的时候。如果有就打开这个功能。及时收集到冰上，并且补充上培养基。

家的感觉

分选得到的细胞数与仪器显示的不符，还有可能是分选接收的细胞进行离心时损失较大。之前分选过脾淋巴细胞亚群，在15ml离心管中总体积较大（比如10ml或更多），离心力或时间不够，导致有的细胞离不下来，加大离心力后发现回收的细胞明显增加，但可能会损伤细胞。所以，分选后离心时离心管中的细胞悬液体积不宜过大，尽量减少细胞损失，使实际计数与仪器显示更接近。