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死活细胞染色、Fc阻断,哪个先哪个后?

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发表于 2024-9-17 22:20:43 | 显示全部楼层 |阅读模式

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论坛上,站友hydwl2019问到:先封闭还是先染死活?

指的是流式样本处理时,死活细胞染色、Fc阻断,哪个先哪个后?

其实DAPI、PI等核酸类死活染料,大家比较容易理解,放在Fc阻断后,上机前.在2010年Cytometry A杂志上,Francois Kuonen等人的文章中提到在小鼠外周血、肿瘤组织染色步骤中,给出了实际例子,采用Fc Block在前(rat anti- mouse CD16/CD32 antibody室温孵育15分钟),再染目标抗体,最后在染DAPI的步骤。

那么对于Live/dead这类胺类染料呢?从一些抗体公司提供的Protocol上来看,Fc Block也是放在最前面的,live/dead染料也是放在前述文献类似的靠后的位置,见:https://www.thermofisher.com/sg/ ... flow-cytometry.html

死活染色、Fc阻断、粘连体排除的重要性
聊到这里,不得不从Francois Kuonen等人的文章进一步深入讲下去。

肿瘤微环境中的髓系细胞在肿瘤发展过程中起着关键作用,包括促进血管生成和肿瘤进展。流式细胞术作为一种强大的技术,可以同时检测多个参数和标记物,在分析肿瘤浸润性髓系细胞亚群方面发挥了重要作用。然而,与分析外周血中的髓系细胞相比,分析肿瘤组织中的髓系细胞需要特别注意一些技术因素,否则可能会导致严重的人为偏差。具体是哪些技术细节呢?就是:
- Fc受体阻断
- 死细胞排除
- 细胞粘连体

Francois Kuonen采用了六色流式细胞术分析从小鼠4T1肿瘤和外周血中分离的CD11b+髓系细胞亚群,使用三种不同的髓系标记物(F4/80、CCR5和Gr1)对CD11b+亚群进行定义。结果证实了死活染色、Fc阻断、粘连体排除对肿瘤组织的结果特别重要:
1、Fc受体阻断对肿瘤浸润性CD11b+细胞亚群的分析非常关键,但对外周血中CD11b+细胞的分析影响较小。未经Fc受体阻断处理的肿瘤样本中,CD11b+亚群的定量和表型分析存在明显偏差。

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2、排除死细胞对肿瘤组织中CD11b+细胞亚群的定量分析影响更大,而对外周血样本的影响较小。这可能是由于肿瘤组织中死亡细胞的比例较高,以及它们在CD45-CD11b分布上的差异。
2024-09-17_22.15.47@2x.png

3、排除细胞粘连体对肿瘤浸润性CD11b+细胞亚群的分析也有重要影响,而对外周血样本的影响较小。肿瘤组织中髓系细胞更容易形成细胞粘连体,这可能反映了它们在肿瘤微环境中更强的粘附性。
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4、当结合多个标记物(Gr1、F4/80和CCR5)分析CD11b+亚群时,上述技术因素的影响更加明显。未经Fc受体阻断和排除死细胞及粘连体处理,Gr1+F4/80+CCR5+和Gr1+F4/80+CCR5-亚群的相对定量会被严重高估。

因此,作者建议在使用多参数流式细胞术分析肿瘤浸润性CD11b+髓系细胞时,同时应用Fc受体阻断、死亡细胞排除和细胞粘连体排除等步骤,是获得可靠结果的关键技术因素。

参考文献:François, Kuonen., Cédric, Touvrey., Julien, Laurent., Curzio, Rüegg., Curzio, Rüegg. (2010). 9. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor‐infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry Part A,  doi: 10.1002/CYTO.A.20969
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发表于 2024-9-18 11:14:29 | 显示全部楼层
今天刚问了BD的技术,他说先染死活再Fc封闭
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 楼主| 发表于 2024-9-18 16:12:53 | 显示全部楼层
hydwl2019 发表于 2024-9-18 11:14
今天刚问了BD的技术,他说先染死活再Fc封闭

Live/dead我觉得差异不会太大,但核酸类肯定只能放最后
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发表于 2024-9-19 00:13:37 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2024-9-18 16:12
Live/dead我觉得差异不会太大,但核酸类肯定只能放最后

倪老师对DAPI,PI和7-ADD更推荐哪一个,PI和7-ADD会跟主流的荧光通道重合,DAPI倒是不会
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 楼主| 发表于 2024-9-19 08:14:20 来自手机 | 显示全部楼层
hydwl2019 发表于 2024-9-19 00:13
倪老师对DAPI,PI和7-ADD更推荐哪一个,PI和7-ADD会跟主流的荧光通道重合,DAPI倒是不会 ...

你说的对的,dapi最适合多色搭配

如果荧光不冲突,7-AAD也可以

至于PI因为激发范围太宽,建议放最后
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发表于 2024-9-20 15:50:07 | 显示全部楼层
一般认为2%血清能抑制一些非特异染色,可以尝试一下看看。
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发表于 2024-9-23 17:56:39 | 显示全部楼层
有人尝试过染完7AAD之后清洗的吗?
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 楼主| 发表于 2024-9-24 07:45:40 | 显示全部楼层
潘臻 发表于 2024-9-23 17:56
有人尝试过染完7AAD之后清洗的吗?

用7-AAD区分死活吗?

标准操作: 建议染色后不进行洗涤,直接进行分析。
染料用量控制:使用推荐的7-AAD浓度,避免过量使用导致不必要的背景信号。
仪器设置优化:正确设置流式细胞仪的电压和补偿,以获得最佳的信号分辨率。
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发表于 2024-9-27 15:14:22 | 显示全部楼层
谢谢倪老师回答。
我们以前实验室有人是把Fc block和7AAD先一起染上,然后在加抗体,最后清洗。感觉好像他跑出来也看不出来什么毛病。所以我就好奇想问一下。
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 楼主| 发表于 2024-9-27 15:16:44 | 显示全部楼层
潘臻 发表于 2024-9-27 15:14
谢谢倪老师回答。
我们以前实验室有人是把Fc block和7AAD先一起染上,然后在加抗体,最后清洗。感觉好像他 ...

看不出问题,可能是将错就错吧,核酸染料提前染,肯定要出问题的
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